大肠埃希菌热不稳定肠毒素B亚单位在婴儿双歧杆菌中的表达

目的将大肠埃希菌热不稳定肠毒素B亚单位(LTB)克隆到表达载体pBV220,使LTB基因在大肠埃希菌和双歧杆菌中稳定表达。方法将LTB基因克隆到表达载体pBV220中,再分别转化大肠埃希菌DH5α和婴儿双歧杆菌,使之表达,表达产物用SDS-PAGE鉴定。并通过家兔肠袢实验验证表达蛋白的安全性。结果LTB基因在大肠埃希菌和双歧杆菌中均可稳定表达,毒性实验证明LTB保留轻微的毒性。结论稳定表达LTB的双歧杆菌为今后的口服疫苗佐剂奠定了基础。

低表达miR-21对苦参碱诱导的肝癌HepG2细胞凋亡的影响

目的:探讨miR-21低表达能否增强苦参碱(matrine,MAT)对肝癌细胞的促凋亡作用。方法:实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测不同浓度MAT作用HepG2细胞后miR-21的表达情况。流式细胞术检测miR-21低表达对MAT诱导的细胞凋亡的影响;RT-qPCR和Western blot检测miR-21低表达对MAT诱导的细胞凋亡中Bc1-2和Bax mRNA和蛋白表达水平的影响。结果:miR-21表达量随MAT作用浓度的增加而增加;miR-21低表达可促进MAT诱导的细胞凋亡,并促进Bax mRNA和蛋白的表达(P<0.05),而抑制Bcl-2 mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。结论:miR-21低表达可通过抑制Bcl-2和促进Bax的表达来增强MAT诱导的HepG2细胞凋亡。

利用球孢链霉菌发酵液消化双歧杆菌细胞壁提取质粒的研究

目的寻找一种经济适用的提取双歧杆菌质粒的方法。方法利用球孢链霉菌发酵产生的变溶菌素来消化双歧杆菌细胞壁,提取质粒,并与商业化溶菌酶法比较。结果球孢链霉菌发酵液与溶菌酶均成功提取到质粒。结论利用球孢链霉菌发酵液提取质粒经济简便。

miR-15a对肝癌HepG2细胞增殖和DLK1表达的影响

目的探讨miR-15a对肝癌中DLK1表达的调节作用和对肝癌HepG2细胞增殖的影响。方法常规培养肝癌细胞系HepG2,经脂质体转染miR-15a模拟物mimic和抑制物inhibitors及各自阴性对照片段NC48 h后,用RT-PCR和Western blot检测DLK1基因及蛋白的表达水平,MTT和流式细胞术(FCM)检测细胞增殖和周期情况。结果 RT-PCR和Western blot结果显示转染miR-15a mimic后DLK1的mRNA和蛋白表达量降低(P<0.05),而转染miR-15a inhibitors后DLK1的mRNA和蛋白表达量升高(P<0.05);MTT结果显示转染miR-15a mimic后细胞的增殖能力明显减慢(P<0.05),而转染miR-15a inhibitors后细胞增殖能力加快(P<0.05)。FCM结果显示转染miR-15a mimic后细胞抑制在G1期。结论过表达miR-15a能抑制DLK1的mRNA和蛋白表达,并抑制肝癌HepG2细胞的增殖。

苦参碱对HepG2细胞DLK1基因表达及细胞生长的影响

目的:探讨苦参碱能否重新诱导HepG2细胞DLK1基因被印记及对细胞生长的影响。方法:RT-PCR检测不同浓度苦参碱处理HepG2细胞后DLK1基因表达水平变化;MTT、transwell和流式细胞术检测苦参碱作用后HepG2细胞的增殖、凋亡及侵袭力的变化。结果:HepG2细胞经苦参碱处理后,DLK1基因的mRNA表达量降低,细胞的增殖能力、侵袭能力均降低,细胞抑制在G1期。结论:苦参碱能有效地抑制DLK1基因的表达,且能抑制肿瘤细胞HepG2生长、增殖和侵袭能力。

木姜子提取物通过促进E-cadherin表达抑制人高转移肺癌95-D细胞的侵袭转移

目的:观察木姜子乙醇提取物(litsea pungens ethanol extract,LPEE)对人高转移肺癌95-D细胞侵袭转移能力的影响,以及对E-cadherin表达的影响。方法:不同浓度LPEE作用95-D细胞,MTT法测定细胞增殖抑制率;transwell迁移实验和Matrigel侵袭实验检测LPEE对95-D细胞迁移和侵袭能力的影响;PCR和Western Blot检测LPEE作用后E-cadherin基因和蛋白水平的表达变化。结果 :LPEE(≥50μg/m L)可显著抑制95-D细胞穿过transwell小室和Matrigel基质胶的数量(P<0.01);PCR和Western Blot结果表明LPEE(≥50μg/m L)可促进E-cadherin m RNA和蛋白的表达量(P<0.05)。结论:LPEE可通过促进Ecadherin的表达来抑制肝癌细胞的侵袭和迁移能力。

新生血管性青光眼患者血清及房水血管内皮生长因子与促红细胞生成素的表达研究

目的探究新生血管性青光眼(NVG)患者血清及房水血管内皮生长因子(VEGF)、促红细胞生成素(EPO)的表达情况。方法选取2013年在赣南医学院第一附属医院就诊并住院治疗的NVG患者20例(A组)、原发性青光眼患者20例(B组)及白内障患者20例(C组)。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测3组患者血清及房水VEGF、EPO水平;采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测3组患者血清VEGF、EPO mRNA水平。结果 3组患者血清EPO水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);B组、C组血清VEGF水平及房水VEGF、EPO水平低于A组(P<0.05);C组血清VEGF水平及房水VEGF、EPO水平低于B组(P<0.05)。NVG患者血清及房水中VEGF水平与EPO水平均无直线相关关系(r值分别为-0.274、-0.182,P>0.05)。B组、C组血清VEGF mRNA水平均低于A组(P<0.05);C组血清VEGF mRNA水平均低于B组(P<0.05);3组患者血清EPO mRNA水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 NVG患者房水中VEGF、EPO水平均较高,而血清及房水中VEGF、EPO水平无直线相关关系,提示VEGF、EPO在NVG的发病机制中可能是相互独立的因素。

苦参碱对人肝癌细胞HepG2增殖及凋亡相关蛋白的影响

目的:研究苦参碱对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其相关机制。方法:用MTT法检测不同浓度的苦参碱作用HepG2细胞后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测苦参碱作用前后HepG2细胞周期的变化;Western Blot检测苦参碱干预HepG2细胞前后Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的改变。结果:苦参碱在浓度≥0.125 mg/m L时有抑制HepG2细胞增殖的作用,且作用随药物浓度的增加及时间的延长而加强(P<0.05)。细胞周期分析显示,随着苦参碱浓度的增加,G_1期细胞比例增加,在0.125、0.500、2.000 mg/m L浓度时分别增加15%、40%、80%,S期细胞比例减少,在0.125、0.500、2.000 mg/m L浓度时分别减少17%、38%、78%。Western Blot检测结果显示,苦参碱可使HepG2细胞中Bcl-2蛋白表达下调,Caspase-3蛋白表达上调;且均呈现剂量依赖性,各个浓度组与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:苦参碱可能通过抑制Bcl-2蛋白表达和促进Caspase-3蛋白表达的方式来抑制HepG2细胞增殖与促进细胞凋亡,其效应与苦参碱的浓度呈现正相关。

原发性青光眼合并2型糖尿病患者房水及血液中MMP-2及TIMP-2的表达

目的探讨基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)及金属蛋白酶2组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase-2,TIMP-2)与原发性青光眼合并2型糖尿病的关系。方法研究对象分A组、B组、C组、D组、E组、F组6组,每组30眼。A组为原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)组,B组为原发性闭角型青光眼(primary angle closure glaucoma,PACG)组,C组为POAG合并2型糖尿病组,D组为PACG合并2型糖尿病组,E组为糖尿病性白内障组,F组为年龄相关性白内障组。采用酶联免疫吸附试验检测各组房水及血清中TIMP-2及MMP-2的含量,并计算TIMP-2/MMP-2值。结果在6组研究对象的房水中,MMP-2浓度在A组为(24.92±6.62)μg·L-1、B组为(36.80±15.07)μg·L-1、D组为(28.44±5.78)μg·L-1,均较F组的(22.87±3.54)μg·L-1显著升高(均为P<0.05);同时房水中TIMP-2浓度在A组为(43.92±19.57)μg·L-1、B组为(76.13±27.67)μg·L-1、D组为(61.92±6.51)μg·L-1,也均较F组的(22.48±3.56)μg·L-1显著升高(均为P<0.05)。A、B、C、D组房水中TIMP-2/MMP-2值较E组和F组显著提高,约为其2倍,但A组、B组、C组、D组间TIMP-2/MMP-2值无显著性差异。在6组研究对象的血清中,A组MMP-2和TIMP-2浓度最高,分别为(396.75±49.30)μg·L-1和(337.67±62.78)μg·L-1,其余各组间MMP-2和TIMP-2浓度无显著性差异。6组研究对象血清中TIMP-2/MMP-2值无明显差异。结论原发性青光眼患者中TIMP-2/MMP-2值均存在失衡,说明MMP-2的活性变化及TIMP-2/MMP-2值与POAG和PACG的发病密切相关,但2型糖尿病对原发性青光眼的病程进展无明显影响。

肺癌患者血清中miR-23a的表达及临床意义

目的：探讨肺癌患者血清中miR-23a的表达情况及其与病例临床特征的关系。方法：提取63例肺癌患者和60例健康体检人血清中总mRNA，采用qRT-PCR方法检测miR-23a的相对表达量；统计分析miR-23a的表达与肺癌侵袭转移和患者耐药的关系。结果：与健康人相比，miR-23a在肺癌患者血清中表达增高（P〈0．01）；miR-23a在淋巴结转移患者血清中的表达量显著高于未转移患者（P〈0．01）；miR-23a在临床I～Ⅱ期肺癌患者血清中的表达低于Ⅲ～Ⅳ期患者（P〈0．05）；miR-23a在非小细胞肺癌患者中的表达高于小细胞肺癌患者（P〈0．05）；miR-23a的表达量在不同年龄、性别、吸烟及不同分化程度的患者中表达差异不显著（P〉0．05）。miR-23a的表达量随患者化疗次数的增多而表达增强。结论：血清miR-23a有可能作为肺癌患者转移及耐药判断的分子标志物。

miR-23a对肺腺癌细胞株A549顺铂耐药性的影响

目的探讨miR-23a对肺腺癌细胞株A549顺铂耐药的影响。方法人工合成miR-23a模拟物mimics和抑制剂inhibitor,用脂质体转染法将其转入A549细胞中,荧光定量PCR检测miR-23a的表达情况;MTT法检测顺铂对A549细胞的半数抑制浓度(IC_(50))和转染后细胞对顺铂药物敏感度的改变;RT-PCR、Western blot检测MDR1、bcl-2基因及其产物P-gp、bcl-2蛋白的表达。结果荧光定量PCR证实转染成功。MTT结果表明顺铂对A549细胞的IC50值为5.2μg/m L。MTT结果表明转染miR-23a mimics的细胞增殖增加,顺铂药敏性降低;而转染miR-23a inhibitor的细胞增殖减少,顺铂药敏性增加。RT-PCR、Western blot结果表明高表达miR-23a可促进MDR1、bcl-2基因及其蛋白的表达,而低表达miR-23a可抑制MDR1、bcl-2的表达。结论 miR-23a可能在肺癌顺铂化疗耐药中有重要作用,抑制miR-23a的表达可增加顺铂对肺癌细胞的敏感性,并降低耐药基因MDR1和bcl-2基因及蛋白的表达。

产肠毒素大肠杆菌定居因子Ⅰ基因克隆与表达

目的:在大肠杆菌DH5α中表达产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenio escherichia coli,ETEC)定居因子CFA/Ⅰ,检测重组表达的ETEC CFA/Ⅰ。方法:以质粒pBV220为基础,构建pBV220-CFA/Ⅰ重组载体,表达产物用SDS-PAGE鉴定,免疫原性实验验证。结果:成功构建了pBV220-CFA/Ⅰ重组载体,表达产物的分子量与天然蛋白相同,动物免疫试验表明重组菌具有免疫原性。结论:CFA/Ⅰ基因的成功克隆为今后的ETEC CFA/Ⅰ候选疫苗研制奠定了基础。

miR-23a对肺腺癌细胞95-D迁移和侵袭能力的影响

目的:研究miR-23a对人肺腺癌细胞95-D增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法:常规培养人肺腺癌细胞95-D,经脂质体转染miR-23a mimic和inhibitors片段后,通过MTT、流式、Transwell实验,观察对95-D细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。结果:MTT结果表明miR-23a mimic可促进细胞生长(P<0.05),miR-23a inhibitors可抑制细胞生长(P<0.05),但抑制率不高;流式结果表明miR-23a对细胞周期影响不大;Transwell实验结果表明miR-23a mimic可以促进细胞侵袭和迁移(P<0.01),而miR-23a inhibitors可以减弱细胞侵袭和迁移能力(P<0.01)。结论:miR-23a可促进肺癌细胞的侵袭转移。

人hIL-24Δ103重组腺病毒感染诱导A549细胞凋亡

白细胞介素24(interleukin24,IL-24)是近年来新发现的1个IL-10家族细胞因子,具有明显的抗肿瘤活性.为了研究开发高活性、低分子量的IL-24,并探讨其用于肿瘤靶向治疗的可能性,本研究在前期基础上,进一步构建并制备了缺失N端103个氨基酸残基的IL-24(hIL-24Δ103)重组腺病毒,并观察了其对A549细胞生长增殖和凋亡的影响.首先,采用PCR技术扩增IL-24第104位至第206位氨基酸区域的编码序列,制备hIL-24Δ103重组腺病毒.用Ad-hIL-24Δ103重组腺病毒感染肺癌A549细胞.MTT分析结果表明,Ad-hIL-24Δ103感染显著抑制了A549细胞的生长.Hoechst 33258染色和流式细胞仪分析结果表明,Ad-hIL-24Δ103感染导致细胞凋亡.Western印迹分析结果表明,Ad-hIL-24Δ103感染导致了PKR和eIF-2α蛋白的表达上调与磷酸化激活,提示PKR和eIF-2α参与了hIL-24Δ103导致的细胞生长抑制和细胞凋亡过程的调节.

敲减NLRC3表达对人正常支气管上皮BEAS-2B细胞生长的影响

目的:探讨敲减含胱天蛋白酶募集结构域的NOD样受体家族蛋白3(NLRC3)表达对人正常支气管上皮细胞株BEAS-2B活力和凋亡的影响及机制。方法:使用Lipofectamine 2000转染试剂将NLRC3基因的小干扰RNA(siRNA)片段转染至BEAS-2B细胞;RT-qPCR筛选干扰片段;MTT法检测细胞活力;JC-1检测细胞线粒体膜电位变化;annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测细胞凋亡率;Western blot检测Bcl-2和Bax的表达水平。结果:NLRC3基因的干扰片段3(siNLRC3-3)干扰效果最佳(P<0. 01)。在BEAS-2B细胞中敲减NLRC3可显著增强细胞活力(P<0. 01)。敲减NLRC3表达可显著升高线粒体膜电位,使细胞凋亡率显著下降(P<0. 05)。敲减NLRC3表达使细胞中Bcl-2蛋白表达水平显著上调,而Bax蛋白表达水平显著下调(P<0. 01)。结论:敲减NLRC3基因可通过上调Bcl-2蛋白表达、下调Bax蛋白表达,增强BEAS-2B细胞活力并抑制其凋亡。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对HepG2肝癌细胞生物学行为的影响

目的研究5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人肝癌细胞株HepG2生物学行为的影响及其机制。方法用浓度为50μmol/L的5-Aza-CdR处理HepG2细胞72 h后,流式细胞仪分析HepG2细胞周期的分布和凋亡的情况;transwell实验检测细胞侵袭能力;RT-PCR检测肝癌中失活的抑癌基因SIAH1 mRNA表达量的变化。并与未经任何药物处理的正常HepG2细胞相比。结果与正常HepG2细胞相比,5-Aza-CdR处理后的HepG2细胞周期阻滞于S期(P<0.05),细胞早期凋亡率增加(P<0.05),且细胞体外侵袭力减弱(P<0.05),SIAH1基因的表达水平明显上调(P<0.05)。结论 5-Aza-CdR可能通过上调SIAH1的表达,调控细胞周期并诱导细胞凋亡,同时抑制HepG2细胞体外侵袭能力。

循环肿瘤DNA中TSHR、RARβ2和RASSF1A启动子甲基化在甲状腺癌早期诊断中的价值

目的研究甲状腺结节患者循环肿瘤DNA中TSHR、RARβ2和RASSF1A启动子甲基化状态,探讨其在甲状腺癌早期诊断中的价值。方法采用甲基化特异性PCR(MSP)对16例甲状腺癌患者和59例良性甲状腺结节患者循环肿瘤DNA中TSHR、RARβ2和RASSF1A基因启动子甲基化进行检测,分析其甲基化率与临床病理之间的关系,并评价其临床诊断效能。结果 TSHR在甲状腺癌组甲基化率为56.3%,与良性结节组(37.3%)间差异不显著(P>0.05);RARβ2和RASSF1A在甲状腺癌组甲基化率分别为37.5%和62.5%,均显著高于良性结节组(3.4%,22%),P<0.01。TSHR基因甲基化率在甲状腺癌患者性别、年龄、不同临床分期间均无统计学差异(P>0.05);RARβ2和RASSF1A基因甲基化率在状腺癌患者性别、年龄间无统计学差异,但与不同临床分期有关(P<0.05)。临床诊断效能比较显示:单独检测RASSF1A基因敏感度和Yonden指数最高,而RARβ2特异性最高。三个基因联合检测,其敏感度、特异性和Yonden指数均最高。结论 TSHR、RARβ2和RASSF1A基因异常甲基化与甲状腺癌发生发展相关,三者联合检测有助于甲状腺癌的诊断。

5-Aza-CdR抑制HepG2细胞DLK1基因表达及细胞生长

目的探讨去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对DLK1基因及肝癌细胞系HepG2增殖、侵袭的影响。方法不同浓度的5-Aza-CdR及PBS作用HepG2细胞后,RT-PCR、Western blot检测DLK1基因及蛋白的表达水平;MTT、Transwell和流式细胞术检测HepG2细胞的生长、侵袭力及细胞周期的变化。结果 HepG2细胞经5-Aza-CdR处理后,DLK1 mRNA、蛋白表达量降低;MTT试验显示细胞生长速度依5-Aza-CdR浓度出现不同程度减慢;流式结果表明G1期细胞减少,S期细胞增加,出现S期阻滞;Transwell证实侵袭能力显著降低(P<0.05)。结论去甲基化药物5-Aza-CdR能有效地抑制DLK1基因的表达,从而抑制肿瘤细胞HepG2生长、增殖、侵袭能力。

人胎盘源间充质干细胞的分离、培养及生物学鉴定

目的:探讨机械剪碎组织加酶液消化法分离、培养人胎盘间充质干细胞的可行性,并对间充质干细胞进行生物学鉴定。方法:取足月产人胎盘,采用机械剪碎组织加酶液消化法分离,密度梯度离心法提纯胎盘组织中的细胞,利用细胞生长特性对细胞进行进一步分离、纯化并传代培养,倒置显微镜观察细胞形态,流式细胞术鉴定细胞表面标记。结果:在倒置显微镜下,细胞为贴壁生长,形态呈长梭形,少数为多角形,胎盘组织来源间充质干细胞在体外可稳定长期传代培养,应用流式细胞仪检测结果显示CD73、CD90、CD105表达阳性,CD34、CD45、HLADR表达阴性。结论:联合利用机械剪碎胎盘组织和酶消化法可高效获取胎盘间充质干细胞,获取的胎盘间充质干细胞在体外培养过程中生长稳定,增殖能力强,可长期传代或冻存。

双黄连逆转肺炎克雷伯菌耐药的体内效果初探

目的:探讨双黄连逆转肺炎克雷伯菌耐药的体内效果。方法:建立耐药的SD大鼠肺炎克雷伯菌模型;再随机分4个治疗组:PBS组、双黄连组、头孢他啶组及联合治疗组;治疗3天后观察各组临床表现,并测定各组大鼠肺内活菌数,以及这些活菌对头孢他啶的药敏效果。结果:临床表现和病理切片结果表明耐药肺炎克雷伯菌大鼠建模成功;各组治疗结果表明,联合治疗组大鼠在临床表现上痊愈,肺内活菌数及活菌的MIC与两个单独治疗组和PBS对照组相比显著减少(P<0.01),而两个单独治疗组的大鼠在临床表现上基本无好转,肺内活菌数及活菌的MIC与PBS组相比相对减少,差异不大。结论:中药双黄连可降低肺炎克雷伯菌大鼠的耐药。