重组人RGD-FasL对胶质瘤细胞U138/U343/U373的体外抗肿瘤的活性分析

目的研究重组人RGD-FasL对3株胶质瘤细胞U138/U343/U373的杀伤作用及机制。方法采用RT-PCR方法、MTT比色法、DNA倍体分析、流式细胞术检测融合蛋白对3株胶质瘤细胞的杀伤作用;利用Western blot法探讨其作用机制。结果FasmRNA在U138和U343细胞中有表达,在U373细胞中未有可见表达;DcR3mRNA在3株细胞中均有表达,在U373细胞中强表达。采用流式细胞术检测肿瘤细胞表面两种受体的表达情况,结果与RT-PCR相符。U138细胞株对RGD-FasL敏感并呈剂量依赖性;U343细胞株对RGD-FasL相对敏感;U373细胞对RGD-FasL不敏感。用PI检测细胞周期与凋亡表明RGD-FasL能使U138/U343细胞停留在G1期,推迟进入S期,抑制细胞生长并诱导细胞发生凋亡。Western blot实验表明RGD-FasL作用细胞后caspase-8/3/9的表达升高,Bcl-2的表达降低。结论重组人RGD-FasL可以不同程度的诱导胶质瘤细胞凋亡,其机制与其受体的表达和caspase-8/3/9、Bcl-2的表达有关。

13-甲基豆蔻酸在大鼠体内的药代动力学研究

目的 研究 1 3 -甲基豆蔻酸在大鼠体内的药代动力学。方法 用毛细管柱气相色谱法测定生物样品中的原形药物浓度 ,在大鼠体内进行血浆药代动力学、分布、排泄及血浆蛋白结合实验。结果 大鼠 ig1 3 -甲基豆蔻酸 40 0 ,80 0 ,1 2 0 0 mg· kg-1后 ,拟合的血药浓度 -时间曲线符合二室模型 ,t1/2α 为 2 .3 1 3～ 2 .843 h,t1/2β 为5 .0 99～ 6 .3 3 9h;tpeak 为 2 .2 1 5～ 2 .76 6 h;血浆蛋白结合率大于 85 .80 %。药物在大鼠体内分布广泛 ,其中心、肺、脾、肝等组织浓度较高 ,肌肉、脂肪等组织相对较低。 2 4 h粪、尿、胆汁原形药物排泄量分别为给药量的1 3 .77% ,0 .0 0 3 2 %和 0 .0 2 1 4%。结论 1 3 -甲基豆蔻酸在大鼠体内吸收快 ,达峰时间短 ,组织分布广泛 ,血浆蛋白结合率高 ;

激光免疫疗法——一种新型肿瘤治疗方法

激光免疫疗法是一种新型肿瘤治疗方法,治疗过程中包括三个基本要素：激光、光敏剂(光吸收剂)和免疫佐剂。该疗法可通过光化学作用在一定范围内破坏肿瘤组织；免疫佐剂还能诱导机体产生免疫反应,杀灭原发肿瘤和转移瘤,并产生肿瘤特异性免疫力,表现出很好的远期疗效。目前应用于激光免疫治疗的有630、652、671、690和810nm波长激光,光敏剂(光吸收剂)有吲哚菁绿、血卟啉衍生物及酞氰类化合物等,免疫佐剂有糖基化聚氨基葡糖、OK-432、MCWE、福氏佐剂及细胞因子等。

肝癌发展中FasL及其受体Fas/DcR3的表达分析

目的研究小鼠肿瘤发生早期肿瘤坏死因子超家族成员FasL及其受体的表达特点,及其与免疫调节相关分子表达的时空关系,探讨其在诱导肿瘤免疫耐受中的作用。方法建立小鼠实体瘤模型,采用RT-PCR方法检测肿瘤组织中可溶型FasL、Fas及DcR3、TGF-β、IL-10在肿瘤发生不同时相的表达,同时,应用ELISA方法定量检测血清中TGF-β、IL-10的表达。结果在早期的肿瘤组织中,Fas的表达先于DcR3,其后DcR3大量表达,而Fas的表达则下调直至丢失,DcR3、FasL同时表达并上调,TGF-β和IL-10也随肿瘤的表达而上调。TGF-β同DcR3的表达具有空间位置的一致性。FasL、DcR3、TGF-β和IL-10的表达水平同肿瘤的生长呈正相关。结论随着肿瘤不断的生长,肿瘤局部的免疫应答逐渐趋向于负调节,FasL、DcR3在诱导肿瘤免疫耐受的过程中可能发挥着重要作用。

诱骗受体DcR3对佐剂型关节炎大鼠模型的作用分析

目的研究诱骗受体DcR3对佐剂型关节炎(AA)大鼠模型的作用及其机理。方法注射弗式完全佐剂建立大鼠佐剂型关节炎(AA)模型,尾静脉注射DcR3蛋白,观察大鼠关节肿胀度、间接ELISA检测血清和滑膜液中细胞因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ的变化。RT-PCR检测滑膜和淋巴细胞中DcR3、Fas、FasL mRNA的表达以及脾脏中TGF-β、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10 mRNA的表达。Western blot分析滑膜细胞中Caspase-8、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2蛋白的表达。结果DcR3治疗AA大鼠后,足肿胀度降低;血液和滑膜液的IL-1β、TNF-α、IFN-γ水平下降;脾脏中TGF-β、IFN-γ、TNF-αmRNA表达下调,IL-4、IL-10 mRNA表达上调;滑膜细胞中Caspase-8、Caspase-3蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调。结论DcR3可以用于实验性大鼠AA的治疗,其治疗机制与调节滑膜细胞FasL、Fas mRNA的表达和血液淋巴细胞中Fas mRNA的表达,促进滑膜细胞和自身反应性淋巴细胞的凋亡;调节脾脏细胞Th1/Th2细胞因子平衡相关。本研究为进一步阐明RA的发病机理奠定了重要基础,为有效治疗RA提供了新思路。

羟乙基壳聚糖抗人死亡受体5单链抗体纳米粒的制备、鉴定及体内抑瘤研究

目的为提高抗人死亡受体5单链抗体治疗肝癌的效果,探讨羟乙基壳聚糖抗人死亡受体5单链抗体纳米粒(GCS-aDR5ScFv)的制备、鉴定并研究其对小鼠肝癌H22模型的治疗效果及机制。方法用亲和镍柱层析法纯化抗人死亡受体5单链抗体(aDR5ScFv),采用离子凝胶法制备GCS-aDR5ScFv,应用扫描电镜来检测GCS-aDR5ScFv的外观形态,激光粒度分析仪分析纳米粒的粒径及粒径分布,并检测其表面Zeta电势。建立小鼠肝癌H22模型,用0.272 mg/ml GCS-aDR5ScFv隔天治疗并测量小鼠体质量及肿瘤大小,治疗2周。通过Western blot检测active-caspase8、active-caspase3及BAX表达。结果纯化的aDR5ScFv符合理论条带(Mr30 000),GCS-aDR5ScFv纳米粒形态均一,纳米粒径大小、Zeta电势和多分散指数表明GCS-aDR5ScFv稳定。与正常组相比,治疗组小鼠体质量显著差异,治疗组肿瘤体积和大小差异显著。Western blot检测active-caspase8、active-caspase3、BAX的表达水平上调。结论本研究制备的GCS-aDR5ScFv稳定,对小鼠肝癌H22模型具有抑瘤作用,其机制可能与active-caspase8、active-caspase3及BAX蛋白表达上调相关。

靶向Neuropilin-1的抗肿瘤研究进展

Neuropilin-1(NRP-1)又称神经鞭毛素蛋白,是一个大小为130～140 kD的非酪氨酸激酶跨膜蛋白,参与脊椎动物胚胎的神经和心血管系统发育。它作为一个多功能受体调节VEGF(血管内皮生长因子),PDGF(血小板衍生生长因子),bFGF(成纤维生长因子)等细胞因子的信号通路,与肿瘤血管新生和肿瘤转移密切相关。NRP-1被认为是一个新的肿瘤治疗靶点,近年来针对NRP-1为靶点的药物研究有不少新进展。本文主要介绍NRP-1的生物学特征,对肿瘤作用以及相关药物研究。

激光免疫疗法对小鼠H22肝癌的长期抗瘤效应

目的观察激光免疫疗法对小鼠H22肝癌的抗瘤效应。方法昆明种小鼠240只,随机分为4组,每组60只。光动力学组:小鼠腹腔内注射HpD10 mg／kg后48 h行激光照射(功率320 W,时间400 s,能量130 J);激光免疫组:处理同前组,另于照光前12 h小鼠瘤内及瘤周注射糖基化氨基葡糖(GC) 0．2 ml／只;单纯GC组:仅于瘤内及瘤周注射GC;对照组:不做任何处理。比较前3个实验组的抑瘤率、生存率。结果3实验组小鼠均有显著抑瘤效果,激光免疫组的抑瘤率、生存率较单纯免疫佐剂治疗组和光动力学治疗组有显著提高,激光免疫组23．3％肿瘤治愈小鼠长期存活。结论激光免疫疗法对小鼠H22肝癌显示出长期抗瘤效应,该疗法可能成为一种长期有效的综合治疗肿瘤新方法。

免疫杀手细胞的体外扩增方法及其对肝癌细胞BEL-7402的杀伤作用

目的:探讨免疫杀手细胞(immune-killer cells,IKCs)的体外扩增方法及其对人肝癌细胞BEL-7402的杀伤作用。方法:改良自然杀伤细胞培养扩增法扩增IKCs细胞,流式细胞仪分析IKCs表型,台盼蓝染色计数法观察细胞增殖状况,AlamarBlue法观察IKCs细胞对BEL-7402细胞的杀伤作用,用BALB/c裸鼠模型检测IKCs细胞对肝癌动物模型的治疗作用。结果:IKCs细胞培养14 d的细胞总数扩增300倍以上,主要由CD3^+CD56^+、CD3^-CD56^+和CD8^+细胞亚群组成,CD3^+CD56^+和CD3^-CD56^+比例达85%以上,CD8^+比例达到77%以上。IKCs细胞对肝癌BEL-7402细胞的杀伤实验显示,当效靶比为25:1时和100:1时,其杀伤活性分别为66.5%和97.8%(P<0.01)。裸鼠肝瘤模型治疗实验显示,IKCs细胞对早期和晚期人肝癌BEL-7402细胞裸鼠模型均有显著的治疗作用,与对照组比较,其抑瘤率达69%以上(P<0.01)。结论:本实验建立的肿瘤免疫杀手细胞IKCs的培养扩增方法是可行的、有效的,有望成为一种新的肿瘤免疫细胞治疗方法。

RGD-FasL羟乙基壳聚糖缓释纳米粒制备及生物学研究

目的使用羟乙基壳聚糖制备纳米颗粒(NPs),用来包载RGD-FasL融合蛋白(RF),鉴定其功能并评估其在肝癌治疗中的作用。方法采用离子凝胶法制备RF羟乙基壳聚糖缓释纳米粒(RF-NPs);通过透射电镜、动态光散射法考察其理化性质;用紫外分光光度仪检测蛋白浓度来计算其载药率、包封率和体外释放度;通过MTT比色法检测对H22细胞增殖活性的影响,应用H22细胞建立小鼠肝癌模型进行体内抑瘤研究。结果制备的RF-NPs呈球形或类球形,平均粒径198.3 nm,Zeta电位+25 mV,包封率较高,且具有缓释效果,150 mg/L浓度时对H22细胞抑制率大于70%,并能在小鼠体内产生比较明显的抑瘤效果。结论离子凝胶法制备RF-NPs的条件缓和、方法简单,是癌症治疗中具有很好的前景的蛋白药物载体。

靶向NRP1单克隆抗体对黑色素瘤细胞B16F10的增殖、迁移和凋亡的影响

目的研究靶向神经菌毛素1(neuropilin1,NRP1)单克隆抗体(NRP1 mAb)对黑色素瘤细胞B16F10增殖、迁移和凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法 SDS-PAGE检测神经菌毛素1单克隆抗体的纯度;蛋白质印迹法、免疫荧光和免疫组化检测神经菌毛素1单克隆抗体的特异性和B16F10细胞及其移植瘤上神经菌毛素1的表达;四甲基偶氮唑蓝法、划痕实验、Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术等方法检测不同浓度神经菌毛素1单克隆抗体对黑色素瘤细胞增殖、迁移和凋亡的影响;蛋白质印迹法检测神经菌毛素1单克隆抗体作用后细胞内相关信号蛋白的表达。结果纯化的神经菌毛素1单克隆抗体具有高纯度和特异性,同时B16F10细胞及其移植瘤上神经菌毛素1高表达。神经菌毛素1单克隆抗体能有效抑制B16F10细胞的增殖和迁移,抑制作用呈时间和浓度依赖性(P<0.05)。神经菌毛素1单克隆抗体能显著诱导B16F10细胞凋亡,并呈剂量依赖关系(P<0.05)。抗体作用后B16F10细胞中磷酸化的Akt和ERK1/2表达下调,Bcl-2和Caspase 3蛋白表达下调,Bax蛋白的表达上调。结论纯化的神经菌毛素1单克隆抗体能有效地抑制B16F10增殖,迁移并明显诱导凋亡,其可能通过抑制膜上神经菌毛素1与相关细胞因子结合而减少其介导的PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信号转导途径的活化来抑制细胞增殖和迁移,并通过Bcl-2/Bax/Caspase3途径诱导细胞凋亡,从而发挥其抗肿瘤作用。

抗人NRP-1单克隆抗体对结肠癌LOVO细胞株的促凋亡作用

目的:研究抗人神经菌毛素1(neuropilin1,NRP-1)单克隆抗体对结肠癌LOVO细胞的促凋亡作用。方法:小鼠腹水法制备抗NRP-1单克隆抗体(NRP-1 MAb)并用rProtein A亲和柱纯化,间接ELISA检测抗体的滴度水平。细胞免疫荧光检测NRP-1蛋白在结肠癌细胞株LOVO上的表达,MTT法检测NRP-1 MAb对LOVO的生长抑制作用,DAPI荧光显微镜法观察细胞凋亡形态,ANNEXIN V-FITC/PI流式细胞仪法检测NRP-1 MAb诱导LOVO细胞凋亡,Western blotting检测凋亡相关蛋白caspase-3、cleaved caspase-3蛋白的表达。结果:SDS-PAGE和间接ELISA检测纯化的NRP-1 MAb纯度为95%、效价为2.56×10-5;细胞免疫荧光染色显示NRP-1定位于LOVO细胞膜;MTT法检测和ANNEXIN V-FITC/PI流式细胞仪法检测结果显示,NRP-1 MAb对LOVO细胞有生长抑制作用和促凋亡作用;DAPI染色·荧光显微镜观察发现,NRP-1MAb可以诱导LOVO细胞核浓缩与碎裂;Western blotting检测到在NRP-1 MAb作用下,LOVO细胞裂解液cleaved caspase-3条带信号增强、caspase-3条带信号减弱。结论:纯化的NRP1 MAb能抑制LOVO细胞的生长并诱导其凋亡。

光敏剂m—THPC在原位移植性肝癌大鼠体内的组织分布和药代动力学研究

目的探讨光敏剂m-THPC在原位移植性肝癌大鼠体内的分布和消除情况，为m-THPC光动力治疗肝癌提供参考和依据。方法大鼠尾静脉注射m-THPC0．3mg／kg后，采用荧光分光光度计法测定组织和血浆中的原形药物浓度，用PK—GRAPH程序拟合并计算药代动力学参数。结果m—THPC血药浓度-时间曲线符合二室模型，血浆分布半衰期（T1/2α）为1．18h，血浆消除半衰期（T1/2p）为22．57h。药物在大鼠体内分布广泛，各组织药物浓度均在40ng／g以上；其中肝脏组织浓度最高，肝癌次之，肌肉、皮肤组织相对较低，给药6h后多数组织药物浓度达到最高，24h后多数组织药物浓度有所下降，而肝癌药物浓度在24h达到最高，肝癌和正常组织药物分配比也达到最高。结论m—THPC在大鼠组织中分布广泛，血浆药物清除相对较快；给药后24h是肝癌光动力治疗的最佳时间窗。