门冬酰胺合成酶启动子区单核苷酸多态性与基因表达量的相关性研究

细胞内门冬酰胺合成酶(asparagines synthetase,AS)的表达水平与白血病细胞对左旋门冬酰胺酶(L-asp)耐药有关。本研究旨在通过筛查发现AS启动子区的单核苷酸多态性(SNP)位点,研究它们对AS基因表达量的影响及寻找对L-asp治疗反应具有影响的个体遗传因素。对82份白血病标本和45份非白血病标本直接测序,筛查AS启动子区的SNP;用实时定量PCR法测定相应标本中的ASmRNA水平。通过对被筛SNP位点不同基因型个体的AS表达水平的统计分析,判断被筛SNP是否对基因表达产生影响。结果发现:被测AS启动子片段内共发现3个SNP位点。分别是-239C/T,-92G/A和-62A/T。其中-92A等位基因在白血病患儿中的发生频率高于非白血病(P<0.05)。AS表达在该SNP的各种基因型个体间存在差异,基因表达水平由高到底依次为GA杂合子型>AA纯合子型>GG纯合子型(P<0.01)。结论:-92A等位基因变异可能与白血病的某些特征相关,并且这个等位基因变异的存在与AS基因的高表达相关。

肿瘤患儿外周血单个核细胞采集及其对受体造血恢复的影响

目的回顾分析26例白血病和实体瘤患儿外周血干细胞采集效果及其对受体造血恢复影响,筛选可能与采集效率提高和受体造血恢复相关的因素。方法总结26例供体的49次粒系集落刺激因子(G-CSF)动员后的外周血采集过程,统计分析供体动员剂量、采集时外周血白细胞、收获的单个核细胞(MNC)和CD34+细胞数、受体造血恢复三者间的相关性。结果26例供体均能很好耐受动员和采集过程。采集物MNC和CD34+细胞中位数分别为4.5×108/kg和1.9×106/kg。动员剂量与采集物中MNC数呈正相关,与采集物CD34+细胞数无相关。采集当天供体外周血白细胞总数对采集细胞量无影响,而MNC水平与CD34+细胞采量正相关。结论受体的造血恢复与采集物中的CD34+细胞数可能存在相关性。因此这类患儿的采集时有必要动态监测其动员时的外周血CD34+细胞水平,确定最佳采集时间,以获取足够的CD34+细胞采量。

胎肝造血前体细胞特征及其临床应用的研究进展

肝脏是胎儿时期的主要造血器官,鼠胚胎12～15 d[1,2]和人胚胎6周至4月是肝脏造血活跃期.在个体发育阶段上,胎肝造血干细胞(HSCs)较骨髓造血干细胞原始;从生理需求角度讲,骨髓HSCs的功能是维持终生造血稳定,其分裂采取群体不对称方式,因此骨髓HSCs数目在人体内保持恒定.而胎肝造血是处于由胚胎造血系统分化形成转向为胎儿日益扩张的循环容量和氧需提供足够红细胞的过渡时期,因此,胎肝HSCs有一个对称分裂以增加自身数目的性能和过程,以便为终生造血稳定提供足够的干细胞贮备[1,3,4].因此可以推测,胎肝造血前体细胞在增殖潜力、多系分化和自我更新能力方面应该比骨髓相应细胞更具优势.本文就近年有关胎肝造血前体细胞生物学特征及其临床应用方面的进展作一综述.

儿童呼吸机相关性肺炎的病原菌分析

目的 探讨儿童呼吸机相关性肺炎（ＶＡＰ）的主要病原菌，指导临床治疗和预防。方法 ３４例ＶＡＰ患儿作气道分泌物细菌或霉菌培养，同时作细菌药敏试验。结果 分离出病原菌１０６株，其中Ｇ－杆菌７２株（６７．９％），依次为不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷白杆菌、肠杆菌属、嗜麦芽假单胞菌、大肠埃希氏菌等；Ｇ＋球菌６株（５．７％ ），分别为甲型链球菌、金葡菌；真菌２８株（２６．４％ ）。对第三代头孢菌素、氨基糖甙类抗药性肠杆菌属为８０％ ，不动杆菌５０％ ；嗜麦芽假单胞菌对亚胺培南的抗药性为８８．９％ ；Ｇ＋球菌对青霉素耐药占８３．３％，对万古霉素１００％敏感。结论 ＶＡＰ的病原菌以Ｇ－杆菌为主，真菌感染也不容忽视。根据药敏合理选用抗生素，避免滥用抗生素，尤其是第三代头孢菌素。

儿童1、2期神经母细胞瘤临床研究

目的：分析1、2期神经母细胞瘤（NB）的临床特征、诊疗方案及远期疗效，为进一步改进治疗方案提供循证依据。方法回顾性分析1998年6月至2010年12月初诊并接受治疗的神经母细胞瘤1、2期患儿的临床资料。结果 NB患儿237例，1期24例，2期25例，1、2期患儿占所有NB患儿的20.7%（49/237）。诊断时的中位年龄25个月（2周~9岁），男29例，女20例。31例（63.6%）患儿因体检或影像学检查意外发现肿块。原发部位以后纵隔和腹部多见，分别为21例（42.9%）、22例（44.9%）。病理类型为预后良好者40例（81.6％）。尿香草苦杏仁酸（VMA）正常者32例（91.4％）。进行检测的患儿血LDH升高均不到正常值5倍。N-MYC扩增1例。10例患儿进入低危组治疗，仅行手术治疗。39例患儿进入中危组治疗，进行了手术及化疗综合治疗。所有49例患儿治疗结束时均获得非常好的部分缓解（VGPR），中位随访时间为60个月（22~148个月），未满5年失访者9例，中位随访时间为3个月（1-32个月）。全组2年、3年、5年无事件生存率（EFS）及生存率（OS）均为100%。结论1、2期神经母细胞瘤预后良好，应进一步减少化疗强度和时间。

儿童晚期神经母细胞瘤自身造血干细胞移植疗效评估

目的评价自身造血干细胞移植(ASCT)和CD34+细胞分选的ASCT对晚期神经母细胞瘤(NB)的疗效。方法回顾性分析2001年6月至2007年4月在上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心诊断为Ⅲ、Ⅳ期NB并完成治疗随访8个月以上患儿的临床资料,比较传统化疗与ASCT和CD34+细胞未分选移植与分选移植的疗效。用荧光定量PCR方法检测CD34+细胞分选前后酪氨酸羟化酶(TH)mRNA表达,监测NB的微小残留(MRD),并评估分选效果。结果55例NB患儿入组,其中Ⅲ期14例,Ⅳ期41例。Ⅲ期中的9/14例和Ⅳ期中的18/41例接受传统化疗;Ⅲ期中的5/14例和Ⅳ期中的23/41例接受ASCT。Ⅳ期13/23例接受ASCT治疗患儿移植物经CliniMACS行CD34+细胞分选处理。所有移植患儿均以卡铂、依托泊苷和美法仑行预处理,平均采得有核细胞(7.1±2.5)×108·kg-1,CD34+细胞(4.0±1.5)×106·kg-1,无一例因移植相关并发症死亡。随访患儿的生存时间及复发率:①Ⅲ期NB:化疗组平均随访33.5个月,3/9例(33%)复发;移植组平均随访37.0个月,1/5例(20%)复发,两组的中位无病生存时间差异无统计学意义,(37.0±15.7)个月vs(18.0±29.9)个月,P=0.446。②Ⅳ期NB:化疗组平均随访20个月,13/18例(72%)复发;移植组平均随访29个月,14/23例(61%)复发,两组的中位无病生存时间差异有统计学意义,(24.0±5.4)个月vs(36.0±2.8)个月,P=0.006。③CD34+细胞分选移植:未分选组平均随访27.8个月,7/10例(70%)复发;CD34+细胞分选组平均随访30.0个月,7/13例(54%)复发,两组的中位无病生存时间差异无统计学意义,(34.0±11.8)个月vs(36.0±5.1)个月,P=0.722。4例移植患儿CD34+细胞分选前后的标本同时进行THMRD检测,结果显示移植前TH阳性的2例标本经分选后全部转阴。结论ASCT能显著延长Ⅳ期NB患儿的长期生存时间,但对Ⅲ期NB患儿的疗效不显著。CD34+细胞分选能达到纯化NB细胞的作用,但可能因病例数较少,尚不能显示出ASCT临床优势。

住院期间运动疗法对造血干细胞移植患儿人体成分影响的探索性研究

目的探索住院期间运动疗法对造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)患儿人体成分的影响。方法便利抽样法选择上海市某三级甲等儿童医院进行HSCT的44例患儿作为观察组;在前期研究的89例患儿中选择一般资料相匹配的43例为对照组。观察组住院期间除了接受常规治疗及饮食外,实施HSCT患儿运动疗法方案。采用重复测量方差分析比较移植前及之后3个时间点两组患儿的人体成分变化,包括身高、体质量、体质指数、体脂肪、去脂体重、骨骼肌等。结果两组患儿的体质量、标化体质量、体脂肪的组间效应的差异具有统计学意义(P<0.05);体质量、标化体质量、BMI、骨骼肌的时间效应具有统计学意义(P<0.05);体质量与时间因素之间存在交互作用(P<0.05)。结论住院期间运动疗法可能会改善HSCT患儿的人体成分状态,有降低移植期间患儿体脂肪蓄积、改善患儿体质量变化的趋势。

FLAG方案治疗小儿复发难治性急性白血病临床研究

目的探讨FLAG方案(氟达拉滨,阿糖胞苷,粒细胞集落刺激因子)治疗小儿复发难治性急性白血病的疗效。方法采用FLAG方案[氟达拉滨30mg/(m^2·d)×5+阿糖胞苷2g/(m^2·d)×5d+粒细胞集落刺激因子5μg/(kg·d)]治疗21例2～13岁的小儿复发难治性急性白血病,其中急性非淋巴细胞性白血病(AML)15例,急性淋巴细胞性白血病(ALL)6例。首次复发(R1)后首选FLAG方案者8例,次选10例,原发难治2例,第三次缓解(CR3)后FLAG巩固治疗1例。结果 21例患儿中1例作为缓解后巩固治疗,1例因化疗后感染死亡而无法评估FLAG应用后缓解率;其他19例可评估患儿中9例(47%)获完全缓解(CR),3例(16%)部分缓解(PR),7例(37%)无效(NR),总有效率63%。其中AML CR率57%,ALL为20%;R1后首选FLAG方案者CR率为57%,次选为20%。应用FLAG后患儿中性粒细胞>0.5×10~9/L的中位时间为21(12～36)天,血小板>20×10~9/L的中位时间为19.4(13～30)天。21例患儿中18例合并感染(86%),除1例死亡外其余均得到有效控制,治疗相关死亡率为4.76%。FLAG治疗后7例患儿进行了造血干细胞移植治疗,目前2例无病存活,分别已移植后无病生存14个月和56个月,其他4例死于移植相关并发症,1例死于移植后复发。另外14例非移植患儿中1例因FLAG相关感染死亡,7例因NR而放弃治疗或合并感染死亡,FLAG治疗有效的6例患儿中2例放弃治疗,4例复发死亡。本组患儿FLAG治疗后中位生存时间5个月。结论 FLAG方案治疗小儿复发难治性白血病疗效肯定,毒副作用可以耐受;AML选择FLAG的疗效优于ALL;复发后首选FLAG治疗效果好于次选者。

人白血病细胞株对L-门冬酰胺酶敏感性与门冬酰胺合成酶表达水平的相关性

本研究探讨人白血病细胞株门冬酰胺合成酶(asparagine synthetase,AsnS)的表达水平及与白血病细胞株对L-Asparaginase(L-Asp)敏感性的关系。用实时定量PCR技术(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)检测Jurkat,HL-60,U937,NB4,THP-1,Namalwa,Karpas299和K562等8种细胞株基础的和经L-Asp处理后的AsnS表达水平,用CCK-8实验检测细胞对L-Asp处理的敏感性。结果表明,8种细胞株之间AsnS的基础表达水平存在很大程度的变异,经L-Asp处理后细胞株的AsnS表达显著上调(p<0.05),AsnS低水平表达细胞对L-Asp相对敏感,而AsnS高表达细胞对L-Asp相对耐药。在8种细胞株中,U937对L-Asp高度敏感,其AsnS表达水平最低,而K562细胞株对L-Asp天然耐药,AsnS表达水平最高。结论:AsnS在天门冬氨酸耗竭后的细胞生物学行为中起着重要的作用,AsnS的表达水平反映了细胞对L-Asp的敏感性,L-Asp在AsnS低表达白血病的治疗中有潜在的应用价值。

异基因造血干细胞移植治疗Ras基因相关性自身免疫淋巴增殖性疾病1例并文献复习

目的:报道1例Ras基因相关性自身免疫淋巴增殖性疾病(Ras-associated autoimmune leukoproliferative disorder,RALD)的病史并探讨RALD的临床特征、基因特点、治疗方法,以提高对本病的认识。方法 :回顾性分析2012年9月至2019年1月于我科诊治的1例RALD患儿临床资料并复习相关文献。结果 :患儿男性,8岁,反复肝肿大、脾肿大6年余,全身淋巴结肿大1年余。2012年8月及2014年8月曾2次因发热、肝大、脾大、外周血三系下降诊断为噬血细胞淋巴组织细胞增生症(hemophagocytic lymphohistiocytosis,HLH),按照HLH方案化疗后完全缓解。2018年4月症状再次出现反复,骨髓涂片、肝穿刺及淋巴结活检排除肿瘤性疾病,基因测序发现NRAS基因c.38G>A(p.G13D)杂合突变,考虑诊断RALD,给予肾上腺糖皮质激素等治疗缓解,于2018年10月行异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT),随访稳定至今。文献共检索到RALD病例25例,其中NRAS突变12例,KRAS突变13例,多为学龄前起病,以肝肿大、脾肿大、淋巴组织增生、自身免疫性血细胞减少、B细胞或单核细胞增多、高γ球蛋白血症等为主要表现,病情多良性迁延,但有白血病、淋巴瘤发病报道,与幼年型粒单核细胞白血病(juvenile myelomonocytic leukemia,JMML)难鉴别。免疫抑制治疗一般有效,其中仅1例患者接受allo-HSCT治疗后痊愈。结论:RALD初始症状不典型,症状发展、治疗相关反应以及多组织基因验证有助于诊断,allo-HSCT对于体细胞突变所致RALD患者治疗有效。

急救绿色通道在急诊医学中的应用

目的 为提高危重患儿的抢救成功率及改善预后 ,探讨最佳的急诊抢救方法。 方法 对我中心 2 0 0 0年 3月—2 0 0 1年 3月经急救绿色通道抢救的 42例危重病例进行回顾分析。 结果 抢救危重患儿 42例 ,其中 2 8例进行了心肺复苏 ,复苏成功率 97 3 %。 结论 急救绿色通道是一种简便、快捷而有效的急救医学模式 。

儿童异基因造血干细胞移植术后感染的实验观察

目的了解儿童异基因造血干细胞移植的感染率和特点。方法对上海儿童医学中心从2002年11月到2004年8月共18例异基因造血干细胞移植的血液肿瘤患儿,发生移植后感染的所有病例进行回顾性分析。结果18例异基因造血干细胞移植患儿,发生细菌、真菌感染的13例,感染率为72·2%;在28株分离菌中,革兰阳性菌14株,革兰阴性菌8株和真菌6株。主要细菌为凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌属、大肠埃希氏菌和克雷伯菌属,且大多数细菌耐药。实时定量PCR监测移植后人类巨细胞病毒(HCMV)感染发现:有16例患儿发生至少一次的HCMV感染,感染率为88·9%。结论感染是儿童异基因造血干细胞移植术后主要的并发症,临床早期诊断、定期监测、及时地合理治疗对降低移植术后感染和提高移植成功率至关重要。

造血干细胞移植治疗X-连锁重症联合免疫缺陷病临床观察

目的:探讨重症联合免疫缺陷(SCID)移植的经验。方法:对我院4例X-连锁SCID患者进行了5次造血干细胞移植(HSCT)。供者采用人类白细胞抗原(HLA)全相合同胞骨髓1例次,母亲半相合CD34+外周造血干细胞2例次,无关脐血2例次。2例次脐血移植者应用了清髓性预处理,并进行移植物抗宿主病(GVHD)预防,其余3例次未进行预处理和GVHD预防。结果:所有患者在活动性感染的基础上接受HSCT。骨髓和外周血移植物平均CD34+细胞为6.45×107/kg,脐血为1.38×106/kg。3例患者移植后2周左右出现Ⅰ～Ⅱ度急性GVHD。最终2例因移植后肺部感染加重死亡,1例因黄疸、肝功能不良放弃治疗,仅1例接受再次脐血移植者经历了首次移植失败、重度肝静脉阻塞病(VOD)、重症肺炎后幸存,该患儿移植后78d自然杀伤(NK)细胞数量接近正常,10个月免疫球蛋白数量恢复正常,13个月T细胞数量接近正常,目前已经随访到移植后15个月。结论:HSCT治疗SCID具有可行性,早期诊断并在严重感染前进行移植是提高移植成功的关键。

儿童急性白血病WT1基因表达的临床意义

目的构建WT1质粒,建立实定量聚合酶链反应(RQ-PCR)监测儿童白血病骨髓样本WT1基因的实验方法,初步研究WT1基因在儿童白血病中的表达特点及临床意义。方法设计合成WT1基因引物探针,利用分子克隆方法构建含有目的基因WT1片段的质粒,并以此作为阳性对照检测儿童白血病骨髓样本。通过Taqman荧光探针RQ-PCR方法分别对WT1目的基因及GAPDH内参基因进行检测,利用双标准曲线法对WT1基因的表达水平进行绝对定量,检测结果用WT1与GAPDH基因拷贝数比值(WT1/104·GAPDH)表示。实验结果应用SPSS13.0软件进行统计学处理。结果经酶切电泳和测序分析证实构建的质粒中成功插入了WT1基因片段,作为RQ-PCR方法中的阳性对照;成功建立了WT1基因的RQ-PCR检测方法。对儿童白血病标本的检测结果显示:初发AML患儿WT1基因表达水平(9.2331±37.6228)明显高于正常对照组(0.0482±0.0348),其次为BCR-ABL阳性的CML患儿(0.1080±0.0616),初发ALL患儿WT1基因表达水平(0.0605±1.6124)与正常组的差异无统计学意义。缓解中的AML患儿WT1基因表达水平(0.3150±0.7216)较初发时明显下降(P=0.000)。结论实验构建的WT1质粒及建立的RQ-PCR方法可用于儿童白血病WT1基因检测。WT1基因的表达水平在一定意义上可作为儿童AML治疗过程中肿瘤负荷的动态监测指标。

获得性再生障碍性贫血二次移植疗效分析

目的探讨获得性再生障碍性贫血(AAA)患儿异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)植入失败后行二次移植的疗效和安全性。方法对2002年7月-2017年12月因allo-HSCT植入失败在上海儿童医学中心行二次移植的AAA患儿的临床资料进行回顾性分析。结果共有283例AAA患儿行allo-HSCT,其中8例因植入失败行二次移植。2例为原发植入失败,6例为继发植入失败。6例在二次移植后14(10~26)天中性粒细胞植活,4例在二次移植后15.5(11~35)天血小板植活。1例在二次移植造血重建前死于感染,1例二次移植发生原发植入失败,5例发生急性移植物抗宿主病,3例发生慢性移植物抗宿主病。中位随访17个月,3例死于感染,5例长期生存(包括2例慢性移植物抗宿主病)。结论二次移植作为AAA患儿植入失败的挽救性治疗,是有效可行的。

造血干细胞移植治疗湿疹血小板减少伴免疫缺陷综合征的临床研究——单中心11年回顾性分析

目的探讨异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)治疗湿疹血小板减少伴免疫缺陷综合征(WAS)的疗效、早期并发症、预后影响因素及脐血作为WAS移植供体选择的可行性。方法对上海儿童医学中心2006年11月-2018年9月接受allo-HSCT的29例确诊WAS患儿的临床资料进行回顾性分析。结果29例WAS患儿接受allo-HSCT治疗,其中13例接受脐血(UCB)移植,16例接受外周血干细胞(PBSC)移植,其中同胞全相合供体(MSD)移植2例,全相合无关供体(MUD)移植8例,不全相合无关供体(MMUD)4例,亲缘不全相合供体(MMSD)移植2例。经环磷酰胺+白消安+抗人胸腺球蛋白清髓性预处理后,所有患儿均获得完全植入。总体2年无病生存率为93%(27/29)。UCB和PBSC移植中性粒细胞和血小板植入中位时间分别为12d vs.11d(P=0.215)和47d vs.26d(P=0.133)。69%患者发生aGVHD,均为2~3度皮肤GVHD,UCB移植患者与PBSC移植患者相比aGVHD发生程度及持续时间无差异(P值分别为0.445和0.345)。不全相合较全相合供体移植aGVHD持续时间更长(P=0.001),但两者间aGVHD发生程度及频率差异无显著性(P=0.875)。导管相关血行感染主要发生于围移植期,发生率26.1%。结论allo-HSCT治疗WAS总体预后好,脐血是WAS患儿合适的造血干细胞来源。

Asparagine Synthetase Is Partially Localized to the Plasma Membrane and Upregulated by L-asparaginase in U937 Cells

This study investigated the intracellular localization of asparagine synthetase （ASNS） in the relation with chemoresistance in leukemia. pIRES-GFP-ASNS-Flag/Neo expression vector was transiently tansfected into SK-N-MC cells and 297T cells respectively. Immunofluorescence and Western blot analysis were performed for cellular localization of ASNS respectively. U937 cells were treated with L-asparaginase for 48 h and examined for endogenous ASNS expression on plasma membrane by immunofluorescence staining. Immunofluorescence staining showed that the transiently expressed ASNS was partly localized on transfected-SK-N-MC cell surface. Moreover, Western blotting exhibited that ASNS expressed both in cytosol and on plasma membrane of transfected-293T cells. Immunofluorescence staining with anti-ASNS-specific monoclonal antibody revealed that endogenous ASNS was localized on the plasma membrane of U937 cells, except for its distribution in the cytosol. In addition, ASNS exhibited a higher expression on plasma membrane after treatment with L-asparaginase as compared with the untreated cells. It was concluded that the subcellular translocation of ASNS may play an important role in L-asparaginase resistance in leukemia cells.

造血干细胞移植治疗Wiskott-Aldrich综合征60例分析

目的:评估造血干细胞移植(HSCT)对于Wiskott-Aldrich综合征(WAS)的治疗效果,并探讨影响预后的相关因素。方法:回顾性分析2006年1月至2020年12月在上海儿童医学中心接受HSCT的60例WAS患儿的临床资料。所有患儿均采用以白消安加环磷酰胺的清髓预处理方案,以环孢素加抗人胸腺球蛋白为主的移植物抗宿主病(GVHD)预防方案。观察患儿移植后植入情况、GVHD情况、移植相关并发症、免疫重建及生存情况。采用Kaplan-Meier法进行生存分析并绘制生存曲线,Log-Rank法进行单因素比较。结果:入组60例患儿均为男性,以感染和出血为主要临床特征,确诊时年龄为0.4(0.3,0.8)岁,移植年龄为1.1(0.6,2.1)岁。20例为人类白细胞抗原(HLA)全相合移植,40例为非全相合移植。有35例接受外周血HSCT,25例为脐血移植。所有病例均完全植入。急性GVHD共29例(48%),仅2例(7%)发生Ⅲ度急性GVHD,慢性GVHD发生率为23%(13/56),均为局限性。巨细胞病毒(CMV)和EB病毒血症分别为21例(35%)及20例(33%),7例发生CMV视网膜炎,3例失明。有5例(8%)患儿发生肝窦阻塞综合征,2例死亡。共有7例(12%)移植后自身免疫性血细胞减少。移植后自然杀伤细胞最早重建,B细胞、CD4^(+)T细胞均在移植后180 d左右恢复正常。本组患儿5年总生存率为93%(95%CI 86%~99%),无事件生存率为87%(95%CI 78%~95%)。无CMV复燃组无事件生存率高于有CMV复燃组[95%(37/39)比71%(15/21),χ^(2)=5.22,P=0.022]。结论:HSCT治疗WAS总体预后良好,尽早对典型患儿实施HSCT可以获得更好的疗效,移植后CMV感染是影响生存的主要因素,加强并发症管理能提高患儿生存情况。