山羊痘病毒SYBR Green I荧光PCR检测方法的建立

为建立山羊痘病毒(goat pox virus,GPV)的SYBR Green I荧光PCR方法,根据GPV的反向末端重复序列(Inverted Terminal Repeat,ITR)的核苷酸序列设计引物。以此引物和山羊痘皮肤痘疹提取的DNA为模板,建立并优化SYBR Green I模式荧光PCR检测GPV的ITR基因的方法,并与普通PCR方法进行敏感性比较。结果表明,此次建立的检测GPV的SYBR Green I荧光PCR方法能检测出7×102拷贝数的DNA模板,此法比文献报道的普通PCR法更敏感、准确、快速。

山羊痘病毒基因组DNA的提取及酶切分析

对山羊痘病毒贵州分离株(LD株和QL株)和参考株(Y株和B株),采用Vero细胞增殖和差速离心浓缩后,以SDS-蛋白酶K法提取病毒基因组DNA,以3种核酸内切酶EcoRⅠ、HindⅢ和PstⅠ进行酶切图谱分析。接种山羊痘病毒48 h^60 h后,Vero细胞呈现典型的细胞病变;病毒基因组提取样本的纯度在1.8~1.9之间,经琼脂糖凝胶电泳均出现一条纯净的DNA条带;经3种内切酶酶切后,贵州分离株的酶切图谱与参考疫苗毒株Y株基本一致,比参考弱毒株B株少3条~4条酶切片段。这为山羊痘病毒毒力基因的进一步研究奠定了基础。

山羊痘病毒TK基因的克隆与序列分析

设计特异性引物并应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y、B株TK基因序列片段,将其克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-TK。再将该重组质粒转化DH5α感受态细胞进行培养,对通过PCR、酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。TK基因核苷酸和氨基酸同源性分析表明,4株测序毒株TK基因与参考毒株的同源性均为96.6%-100%,说明羊痘病毒TK基因具有高度的保守性。

猪源多杀性巴氏杆菌的生物学鉴定与荚膜PCR分型

从表现猪萎缩性鼻炎临床症状的猪群中分离出13株多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm),采用Pm种特异性的KMT1-KMT2引物进行PCR扩增,结果与传统的生化反应鉴定完全一致。基于对甘露醇、卫茅醇、山梨醇、海藻糖的发酵能力和产生鸟氨酸脱羧酶的特性,Q_1、Q_3、Q_6、Q_7、Q_(10)、Q_(13)和C_(48-1)鉴定为Pm多杀亚种(Pm subsp.multocida);Q_2、Q_4、Q_5、Q_8、Q_9、Q_(11)、Q_(12)鉴定为Pm败血亚种(Pm subsp.septica)。对13株Pm分离物采用A型、B型和D型引物进行PCR扩增,8株鉴定为A血清型(61.5%);5株鉴定为D血清型(38.5%);没有发现B血清型的菌株。同时对金黄色葡萄球菌抑制试验、中性吖啶黄沉淀试验与荚膜PCR分型的相关性进行了讨论。

猪萎缩性鼻炎支气管败血波氏杆菌PCR检测方法的建立

对表现猪萎缩性鼻炎临床症状的猪群中分离得到的34株支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb),采用针对Bb flagellum gene的一对引物进行PCR扩增,结果所有分离物均能扩增出237bp特异性DNA条带,与传统生化鉴定结果相一致,且其最小检出量为0.64pg;而猪鼻腔和肺组织中常见的多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌及大肠埃希氏菌均未能出现任何DNA条带。这表明,本试验建立的PCR方法具有特异性强、灵敏度高、可靠性好等特点,可用于猪萎缩性鼻炎的临床诊断。

猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查与RT-PCR鉴定

对贵州省11个猪场出现的疑似猪繁殖与呼吸综合征病例进行流行病学调查和病原RT-PCR鉴定,结果表明,发病仔猪主要表现高热,死亡率为40.35%(642/1 591);3个种猪场的待产母猪群发生繁殖障碍,流产率为8.11%(38/469);成年猪群发病率为24.47%(162/662),死亡率为4.35%(30/662);感染猪群PRRS血清抗体平均阳性率为28.12%(45/160)。对病死猪病料进行PRRS病原核酸鉴定,其平均检出率为84.44%(38/45),变异毒株试剂盒检测显示,11个临床发病猪场病例是由变异毒株引起的高致病性猪繁殖与呼吸综合征。

山羊痘直接荧光抗体检测方法的建立与应用

用兔抗山羊痘病毒IgG制备荧光抗体,检测了临床发病山羊皮肤痘疹切片和山羊痘病毒B、Y、LD和QL株感染的BHK-21细胞中的病毒抗原。结果,皮肤痘疹切片、感染细胞抹片及飞片均呈阳性,而正常山羊皮肤和细胞对照为阴性;荧光抗体的最适工作浓度为1∶32,且这种荧光可被山羊痘标准阳性血清特异性抑制。表明,建立的山羊痘直接荧光抗体检测方法能对临床发病山羊皮肤痘疹和感染细胞中的山羊痘病毒抗原进行定位检测,为临床诊断山羊痘提供了一种简单快速的方法。

一株猪细小病毒的分离与鉴定

取疑似猪细小病毒(PPV)流产胎儿组织病料,处理后接种PK-15传代细胞,2～4 d后出现了明显的细胞病变;荧光抗体试验结果显示,PPV呈现阳性;以猪细小病毒VP2基因的1对特异性引物,从PPV疫苗、流产胎儿病料及感染细胞培养物中PCR扩增出158 bp的DNA条带;扩增产物经EcoR I酶切分析,得到了预期的条带(123 bp和35 bp),从而证实PCR方法的特异性;敏感性试验结果显示,PCR的最小检出量为300 pg.研究结果表明,2006年9月发生在贵州省某种猪场的疫情确由猪细小病毒感染所致.

山羊痘病毒ITR基因片段的克隆与序列分析

应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y和B株ITR基因片段,插入pMD18-T载体,转化DH5α感受态细胞,提取重组载体经PCR和酶切鉴定后测序,并与GenBank上8株羊痘病毒相应序列进行同源性分析。结果经PCR扩增,4株病毒均可得到一条均一的DNA片段,该片段可被内切酶AluⅠ特异酶切,而且该PCR的DNA模板最小检出量为24.40pg。经测序,该基因片段长度为289bp;序列比较发现,4株病毒ITR片段与GenBank上2株山羊痘病毒的核苷酸与氨基酸序列同源性均为100%,与3株绵羊痘病毒分别为98.2%和96.5%,与3株牛疙瘩皮肤病病毒为98.2%～99.3%和96.5%～97.7%。这表明ITR基因片段在羊痘病毒属中较为保守,可以针对ITR基因建立羊痘病毒的PCR检测方法。

支气管败血波氏杆菌的鉴定及药敏试验

从猪萎缩性鼻炎(AR)临床症状猪群分离出34株疑似支气管败血波氏杆菌(Bb),对分离菌进行形态结构、染色特性、培养性状和生化特性等方面的测定,结果这些分离菌均符合Bb的生物学特征;对BbFlaA基因进行PCR扩增,所有分离菌均能扩增出特异性DNA条带,与传统方法的鉴定结果完全一致,且最小检出量为0.64pg;而猪鼻腔和肺组织中常见的多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌及枯草芽孢杆菌均未出现任何DNA条带。药敏试验显示,这些分离物对多黏霉素B、丙氟哌酸、氟哌酸、卡那霉素和庆大霉素均表现高度敏感。

C型产气荚膜梭菌肠毒素基因的克隆与序列分析

研究参照国外发表的产气荚膜梭菌肠毒素全基因序列设计合成1对特异性引物，采用PCR技术对C型产气荚膜梭菌贵州分离株（CP2株）肠毒素基因进行扩增，将扩增产物连接到pMD18-T载体，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒进行PCR和双酶切鉴定后测序。结果：获得的基因序列全长960bp，编码319个氨基酸。同源性分析结果表明贵州分离株CP2株与产气荚膜梭菌参考株肠毒素基因序列的核苷酸同源性为99．4％99．8％，推导氨基酸同源性为99．1％～99．7％。

产气荚膜梭菌cpe^+菌株的筛选与鉴定

参考相关资料,针对产气荚膜梭菌肠毒素基因(cpe)设计合成1对特异性引物,对34株贵州分离株进行PCR扩增,并将扩增产物连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取质粒进行PCR和双酶切鉴定后测序和分析。结果在34株产气荚膜梭菌贵州分离株中有1株C型菌株扩增出与预期大小相一致的目的片段,经克隆测序后,该片段大小为233 bp,其与产气荚膜梭菌参考株肠毒素基因序列的核苷酸同源性为99.6%~100%,推导氨基酸同源性为98.7%~100%,表明所扩增产物为产气荚膜梭菌的肠毒素基因片段。本试验筛选鉴定出1株产气荚膜梭菌cpe+菌株,为今后进一步探讨产气荚膜梭菌性食物中毒机制奠定了基础。

猪繁殖障碍疫病的三重PCR法鉴别诊断

为建立一种简便、快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)3种病原的多重PCR方法,针对PRRSV N基因、PPV VP 2基因及PRV gp50基因分别合成了1对特异性引物,通过PCR均扩增出分子长377bp、445bp和217bp的DNA条带,与预期扩增片段相符。以3对引物同时对PRRSV、PPV和PRV疫苗株进行多重PCR扩增及反应条件的优化,同时扩增出3条特异性条带。利用所建立的多重PCR方法,对贵州省11个养猪场的40份疑似病料进行检测,结果显示,PRRSV、PPV和PRV的阳性检出率分别为62.5%、17.5%和0%。

产气荚膜梭菌肠毒素基因原核表达载体的构建

以含C型产气荚膜梭菌分离株(CP2)肠毒素基因的克隆载体pMD18-T-cpe为材料,根据产气荚膜梭菌开放阅读框设计合成一对特异性引物,采用PCR技术对其进行扩增,经BamHI和EcoRI双酶切后,从胶上回收目的基因,与经过相同两种内切酶处理的原核表达载体pET32a连接,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞后,提取质粒进行PCR和BamHI/EcoRI双酶切鉴定后测序。结果表明,肠毒素基因已成功地克隆到原核表达载体上(重组质粒命名为pET32a-cpe),从而构建了产气荚膜梭菌肠毒素基因的原核表达质粒。

出口蓝莓基地病虫害调查初报

为全面了解出口蓝莓病虫害发生及为害情况,2013—2015年在贵州出口蓝莓种植基地进行系统调查。共发现为害蓝莓的病虫害20种,其中病害9种,包括生理性病害2种,分别是红叶病和黄叶病,侵染性病害7种,分别是灰霉病、根腐病、白粉病、炭疽病、锈病、溃疡病和根癌病;虫害11种,分别是果蝇、金龟子(小青花金龟、铜绿丽金龟、斑喙丽金龟)、蚜虫(桃蚜、苹果黄蚜)、蝼蛄、小地老虎、叶蝉、天牛和木蠹蛾。对病虫害及其为害程度进行综合分析,确定为害严重的病虫害主要是灰霉病、金龟子和果蝇。

甜瓜产业应对国际农药残留技术性贸易壁垒分析

我国是甜瓜种植面积和产量第一大国,但在国际出口市场所占份额较少,制约我国甜瓜出口的重要阻力是农药残留等技术性贸易壁垒。笔者以越南和新加坡、美国和欧盟分别作为主要出口、待进入高端市场代表,研究不同市场甜瓜农药最大残留限量及管控要求,提出符合我国产业的应对措施,为提升甜瓜质量安全水平与国际竞争力,稳定现有市场、扩大高端市场份额,增加产业效益与利润提供科学指导。