3种杀螨剂对松毛虫赤眼蜂和七星瓢虫的毒性风险评估

为明确30%乙螨唑悬浮剂、23%阿维菌素·乙螨唑悬浮剂和15%乙螨唑·唑螨酯悬浮剂等3种杀螨剂对松毛虫赤眼蜂和七星瓢虫的急性毒性效应和初级风险,采用试管药膜法分别测定了3种杀螨剂对松毛虫赤眼蜂和七星瓢虫的急性毒性,并预测杀螨剂在农田内外的暴露量,表征毒性风险。结果表明:3种杀螨剂对松毛虫赤眼蜂急性接触毒性LR50为0.255~63.400 g a.i./hm^(2);对七星瓢虫的急性接触毒性LR_(50-48 h)和LR_(50-16 d)分别为9.30~21.70 g a.i./hm^(2)和3.72~8.36 g a.i./hm^(2)。30%乙螨唑悬浮剂和15%乙螨唑·唑螨酯悬浮剂在农田内外对松毛虫寄生蜂的危害商值HQ均小于5,风险可接受;23%阿维菌素·乙螨唑悬浮剂在农田内外对松毛虫寄生蜂的危害商值HQ均大于5,风险不可接受;30%乙螨唑悬浮剂和23%阿维菌素·乙螨唑悬浮剂对七星瓢虫的农田内危害商值HQ均大于5,风险不可接受;15%乙螨唑·唑螨酯悬浮剂对七星瓢虫的农田内危害商值HQ均小于5,风险可接受;3种杀螨剂对七星瓢虫的农田外危害商值HQ均小于5,风险可接受。综之,2种复配杀螨剂相比单剂的毒性增大,30%乙螨唑悬浮剂和23%阿维菌素·乙螨唑悬浮剂对非靶标节肢动物的风险均不可接受,农药施用时需采用一些风险降低措施来减轻对松毛虫赤眼蜂和七星瓢虫的风险。

褐飞虱核受体基因NlE75的分子特性和功能分析

【目的】蜕皮激素通过信号级联反应调节昆虫的蜕皮和变态过程,而核受体基因E 75是信号通路的早期响应基因。本研究旨在分析褐飞虱Nilaparvata lugens NlE75的分子特性及生物学功能,为褐飞虱的防治和新农药的开发提供新分子靶标。【方法】本研究基于序列比对和同源检索以及褐飞虱转录组数据获得NlE75的cDNA序列,并利用RT-PCR和RACE技术对其进行cDNA克隆;利用生物信息学软件预测分析NlE75编码蛋白的结构特性;利用MEGA5.0邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统进化树。利用RT-qPCR检测NlE 75及其转录本在褐飞虱不同发育阶段(卵、1-5龄若虫和成虫)、5龄若虫不同组织(头、胸、腹、表皮、翅芽、脂肪体、中肠和足)中和3龄若虫被注射0.2μg/头20-羟基蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)后的表达谱。通过注射法进行RNAi敲降褐飞虱3龄若虫20E合成关键基因NlCYP314A 1后,利用RT-qPCR检测3龄若虫中NlE 75的表达量;通过注射法进行RNAi下调3和5龄若虫NlE75及3龄若虫中其转录本的表达后,利用RT-qPCR检测3龄若虫中NlE 75及其转录本的表达量,观察敲降NlE 75对褐飞虱3和5龄若虫蜕皮和变态的影响,分析NlE75的5个转录本的相互调控关系。【结果】克隆获得褐飞虱NlE 75的5个转录本,分别命名为NlE75A,NlE75B,NlE75C,NlE75D和NlE75E(GenBank登录号分别为ON086330,ON086331,ON086332,ON086333和ON086334),其编码蛋白均具有典型的核受体保守结构域;系统进化分析发现其与人体虱Pediculus humanus corporis和德国小蠊Blattella germanica的E75蛋白聚在一起。RT-qPCR结果显示,NlE75基因5个转录本具有不同的发育和组织表达特性;NlE75A和NlE75D的表达量在褐飞虱各发育阶段均较低,NlE75A,NlE75B和NlE75C的表达动态与NlE75一致,NlE75D在4龄和5龄蜕皮前表达量增至最高,而NlE75E在成虫中的表达量最高;NlE 755个转录本在5龄若虫各个组织中均有表达,但NlE75B,NlE75C,NlE75D和NlE75E在足中高表达,而NlE75A在脂肪体中高表达。20E诱导后4和8 h时,处理组NlE75的表达量较对应的对照组分别上调了4.7和5.0倍,而RNAi干扰褐飞虱NlCYP314 A1后48 h时处理组NlE 75的表达量较对照组(注射ds GFP)极显著下调了47.8%;RNAi结果表明在3龄若虫中注射ds NlE 75后导致褐飞虱蜕皮困难,出现畸形虫体;在5龄若虫中注射ds NlE75导致褐飞虱变态终止,出现畸形虫体;3和5龄若虫注射ds NlE75均无法完成蜕皮过程并最终100%死亡。只有对5个转录本均干扰后才出现畸形表型,而对单一转录本干扰后则不出现畸形表型,说明NlE75基因5个转录本之间存在着复杂的调控关系。【结论】褐飞虱中NlE75基因具有5个转录本,具有不同的发育和组织表达特性;RNAi结果表明,NlE75基因5个转录本存在明显的功能冗余现象,NlE75基因在褐飞虱蜕皮过程发挥重要作用。

土壤和水中啶氧菌酯的环境行为研究

通过对啶氧菌酯在三种典型土壤(潮土、褐土和红壤土)和水中挥发性、光降解和淋溶性的研究,明确了其环境行为。啶氧菌酯在三种土壤表面和水中,24 h吸收液中未检测到挥发的啶氧菌酯;啶氧菌酯在三种土壤表面的光降解半衰期分别为潮土26.70h、褐土32.80 h和红壤土12.80 h,在水中的光解半衰期为3.20 h;啶氧菌酯在三种土壤中的迁移率分别为潮土0.083、褐土0.08、红壤土0.25。结果表明:啶氧菌酯在三种土壤和水中均难挥发,在土壤表面难光降解,而在水表面较易光降解;在潮土和褐土中移动性等级为不移动,而在红壤中移动性等级为不易移动。综上认为,啶氧菌酯在三种土壤中稳定性高、迁移率低,长期高频次施容易导致土壤中啶氧菌酯累积,而在水中易于降解,不容易累积。

温度和湿度对土壤中噁唑酰草胺降解的影响

噁唑酰草胺是一种芳氧苯氧丙酸酯类除草剂,近年来在我国使用面积快速上升。本文建立了土壤中噁唑酰草胺的快速灵敏检测方法,测定了土壤温度和湿度对土壤中噁唑酰草胺降解的影响。研究结果表明建立的土壤中噁唑酰草胺的高效液相色谱检测方法,最低定量限(LOQ)为4.00×10^(-3)μg/kg,最低检测限LOD为1.20×10^(-3)μg/kg。土壤温度为5、15、25和35℃时,土壤中10 mg/kg的噁唑酰草胺半衰期分别为16.8、9.9、3.5和0.9 d;土壤湿度为40%和80%时,土壤中噁唑酰草胺的半衰期分别为3.6和4.3 d。与土壤湿度相比,土壤温度对土壤中噁唑酰草胺降解的影响更大。

辣椒青枯病菌的分离及其PCR检测

从辣椒上分离的青枯病菌用TTC、523平板划线培养可得到典型的单菌落(中央粉红色或红色,具流动性),共分离到20个纯培养物。实验不需要提取青枯病菌的DNA,可直接利用细菌粗悬液进行PCR扩增反应,并克隆到281 bp的分子片段。实验结果为鉴定辣椒青枯病菌株提供了一种快速特异的检测手段。

湖南省安仁白背飞虱种群对5种农药敏感度测定

为明确湖南省安仁地区白背飞虱种群对不同防治农药的敏感度,指导该地区白背飞虱田间药剂防治,测定了湖南省安仁县白背飞虱种群3龄若虫对5种农药的敏感度。测定结果表明,湖南省安仁县白背飞虱种群对噻虫嗪、噻嗪酮、吡虫啉、烯啶虫胺、异丙威的敏感度(LC50),分别为0.0299、0.1214、0.1322、0.3296、26.7068 mg/L。5种药剂中,异丙威的敏感度最低,生产上应控制施用。

21.2%春雷·四氯酞可湿性粉剂防治辣椒疫病田间药效试验

对21.2%春雷·四氯酞可湿性粉剂防治辣椒疫病(Phytophthora capsici)田间效果进行了试验。结果表明:该混配药剂对辣椒疫病有较好的防治效果,用量为800倍、600倍、400倍时,对辣椒疫病的防效分别为63.36%、74.95%、80.88%,与空白对照相比其增产率分别为7.48%、14.50%、19.79%。

一株光合细菌分离鉴定及其降解甲氰菊酯特性

从某农药厂的排放口污泥中筛选分离甲氰菊酯高效降解光合细菌PSB07-28,根据菌株生理生化特征以及16S rDNA序列同源性鉴定降解菌,气相色谱法测定降解甲氰菊酯的能力,渗透休克法提取降解粗酶,测定其降解能力,定位降解酶.结果表明,PSB07-28菌株属红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp),对甲氰菊酯的最高耐受质量浓度为800mg/L,降解最佳条件为35℃,pH7.在最佳降解条件下,光照培养15d,对600mg/L甲氰菊酯降解率达42.49%.降解酶定域结果表明,降解酶是胞内酶.

苯醚甲环唑在芹菜和土壤中的残留行为及风险评估

在湖南和山东开展了10%苯醚甲环唑水分散粒剂在芹菜上的残留田间试验,在室内进行了土壤生物的急性毒性试验。基于苯醚甲环唑的残留试验数据和毒性端点值,就苯醚甲环唑对中国不同人群的长期及短期膳食摄入风险和对土壤生物的环境风险进行了评估。结果表明:苯醚甲环唑在芹菜叶、茎和土壤中的消解半衰期分别为5.2~8.8 d、8.0~8.2 d和13.6~15.0 d。苯醚甲环唑按推荐剂量有效成分120 g/hm^(2)喷雾施药3次,施药间隔期5 d,距最后一次施药5 d收获时苯醚甲环唑在芹菜叶片中的残留量高于MRL(3 mg/kg,中国),在茎和整株芹菜中的残留量均低于MRL。普通人群和1~6岁儿童的短期摄入风险商(RQ_(a))值分别为0.09和0.10;对于不同人群,芹菜中苯醚甲环唑对长期膳食摄入风险商的贡献率(RQ_(c)%)为9.4%~19.8%。10%苯醚甲环唑水分散粒剂对环境中的土壤生物风险商(RQ_(e))值为0.368~0.890,不会产生初级急性风险。

4种小作物中嘧菌酯残留量的检测及膳食风险评估

目的建立超高效液相色谱-串联质谱联用法检测4种小作物(茄子、苦瓜、葱和蕹菜)中嘧菌酯残留的分析方法,探明嘧菌酯在4种小作物中的残留特性和使用安全性。方法样品经乙腈提取,QuEChERS方法净化,在电喷雾正离子(electrospray positive ion,ESI+)模式下,用UPLC-MS/MS采用多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式检测。结果嘧菌酯在0.001~2 mg/L浓度范围内溶剂标准曲线和空白基质匹配标准曲线均有良好线性,相关系数在0.9989~1之间。在0.01~20 mg/kg添加水平内平均回收率为73.5%~109.7%,相对标准差(relative standard deviation,RSD)为1.5%~8.9%,方法的检出限(limits of detection,LOD)为0.001 mg/L,最低检测浓度(limits of quantification,LOQ)为0.01 mg/kg。25%嘧菌酯水分散粒剂在4种小作物中的半衰期分别为3.9、2.7、4.6和2.5 d;连续多次施药10 d后在茄子和苦瓜中残留量最大值分别为0.015 mg/kg和0.018 mg/kg;连续多次施药14 d后在葱和蕹菜中残留量最大值分别为1.43 mg/kg和0.450 mg/kg;膳食风险商值(risk quotient,RQ)为0.0002~0.0959,均低于1。结论该方法简便、快速、灵敏度高,能有效克服杂质干扰,膳食风险结果表明使用25%嘧菌酯水分散粒剂防治蔬菜病害风险较小,相对安全。

水稻橙叶病植原体16S rDNA基因的序列分析

利用植原体16S rDNA通用引物对水稻橙叶病发病植株的DNA进行了PCR扩增和基因克隆.序列测定表明,PCR扩增的片段全长为1 853 bp,包括1 527 bp的水稻橙叶病植原体(RYL)的16S rDNA基因全序列、234 bp的邻近间隔区的序列及部分(92 bp)23S rDNA基因序列.序列比较结果表明,RYL的16S rDNA全序列与其他植原体的相似性在88%～95%,其中与America aster yellows(AAY,GenBank登录号X68373)最高相似性为95%.利用最大简约法构建的16S rDNA系统演化树结果表明:RYL与AAY亲缘关系最近,同被聚类为翠菊黄化组(16Sr I).

分散固相萃取-超高压液相色谱-串联质谱法测定黄瓜中的嗪胺灵

目的：建立黄瓜中嗪胺灵残留的液质串联快速分析检测方法。方法样品中的嗪胺灵经乙腈提取用 N-丙基乙二胺(PSA)和石墨化碳黑(GCB)净化,利用超高压液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)在多反应监测模式下进行检测。结果以碎片离子对432.8>212.9、432.8>82.9定性、离子对432.8>97.8进行外标法定量。仪器在0.01~1.00 mg/kg范围内,具有良好线性关系。在0.02~1.00 mg/kg添加水平范围内,嗪胺灵在黄瓜中的平均回收率为85.3%~92.2%,其相对标准偏差为2.8%~7.5%。该方法的检出限(LOD)为2.0μg/kg,定量限为(LOQ)为20μg/kg。结论本方法简便、快速、准确,能满足国内外法规的要求,可用于黄瓜样品中嗪胺灵的农药残留确证检测。

水稻橙叶病PCR检测体系的建立

利用植原体通用引物sP1和sP2,采用PCR法从发病的水稻植株中扩增植原体一段保守的16S rRNA基因的核苷酸序列.结果表明,从发病的水稻植株中都能够稳定扩增得到1条558 bp的特异性条带.对该条带进行克隆和序列分析表明,该片段和Genbank中公布的众多植原体的相应区域的核苷酸序列相似性都高达95%以上,表明利用植原体通用引物能有效扩增得到水稻橙叶病原的序列.利用此引物并优化PCR反应条件,建立了水稻橙叶病的PCR检测方法.该方法对检测水稻橙叶病具有特异、灵敏和有效性.应用该检测体系检测从广东信宜、高州和从化采集的多份疑似标样,结果表明,在这几个地区均有水稻橙叶病的发生和危害.

啶氧菌酯降解菌的分离鉴定及其降解特性

通过富集培养法筛选分离到1株能以啶氧菌酯为唯一碳源的降解菌株PID-1,采用形态学、生理生化方法,并结合16S r DNA序列系统发育分析,将菌株PID-1初步鉴定为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。菌株PID-1降解啶氧菌酯的最佳条件为p H 7和35℃。在该降解条件下,培养5 d,菌株PID-1对100mg·L-1啶氧菌酯的降解率可达83.54%。将啶氧菌酯经PID-1降解后的物质经质谱扫描,通过谱库检索,发现其降解中间产物包括1-(1,5-dimethylhexyl-)-4-methyl-benzene、2,5-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol、butyl 2-methyoxyethyl ester、bis(tert-butyldimethylsilyl)ester、1-(3-n-propoxyphenyl)-2-propanone oxime和2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenol。

啶氧菌酯降解菌的分离鉴定及其降解特性研究

【目的】筛选可高效降解啶氧菌酯的微生物资源,并研究其降解特性,为啶氧菌酯等甲氧基丙烯酸酯类农药残留的微生物修复提供新资源。【方法】采用富集培养法分离啶氧菌酯降解菌,以生理生化特征结合16S rRNA序列系统发育分析鉴定降解菌;利用气相色谱仪(HPLC)测定啶氧菌酯残留量,分析其降解特性;采用气相色谱质谱联用仪(GCMS)测定降解菌降解啶氧菌酯的中间代谢产物,分析降解菌降解啶氧菌酯的代谢途径。【结果】分离获得一株能以啶氧菌酯为唯一碳源的降解菌株(PY3),其生理生化特征结合16S rRNA序列系统发育分析结果表明,PY3菌株属沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。PY3菌株最佳生长条件测定和降解特性分析结果表明,PY3菌株生长和降解啶氧菌酯的最佳条件为pH6.0、35℃,在最佳降解条件下培养11d,对50mg/L啶氧菌酯的降解率可达72.0%。PY3菌株降解啶氧菌酯的途径包括苯环和N杂环间氧桥键断裂后酯化,以及苯环和N杂环开环反应。【结论】沼泽红假单胞菌PY3菌株具有高效降解啶氧菌酯的活性和较广的pH和温度耐受性,且具有应用于农田生态环境中啶氧菌酯等甲氧基丙烯酸酯类农药残留物微生物修复的潜力。

马拉硫磷在西葫芦中的残留行为及膳食摄入风险评估

利用气相色谱-火焰光度检测器（GC-FPD）测定了马拉硫磷在西葫芦中的残留量,根据2016年湖南、山东、北京、安徽、山西和黑龙江6地马拉硫磷在西葫芦中的规范性残留试验,对中国各类人群和不同作物中的马拉硫磷进行了膳食风险评估。样品用乙腈提取,丙酮置换乙腈后,GC-FPD检测。结果表明：在0.02~8.0 mg/kg添加水平下,马拉硫磷在西葫芦中的回收率在88%~109%之间,相对标准偏差（RSD）为5%,定量限（LOQ）为0.02 mg/kg。湖南和山东的消解动态试验结果显示,马拉硫磷的半衰期为2.74~4.65 d,属于易降解农药;6地的最终残留试验结果表明,距最后一次施药3、5、7 d后,西葫芦中马拉硫磷的最终残留量在〈0.02~0.049 mg/kg之间。针对西葫芦的膳食风险评估结果显示,中国各类人群对马拉硫磷的国家估计每日摄入量（NEDI）为0.115~0.207μg/（kg bw·d）,风险商值（RQ）为0.000 4~0.000 7;全膳食暴露风险评估结果显示,马拉硫磷在各类食物中的NEDI值为82.251μg/（kg bw·d）,RQ值为0.275 1,表明马拉硫磷在西葫芦中的长期膳食摄入风险较低。推荐中国马拉硫磷在西葫芦上的最大残留限量值（MRL）为0.1 mg/kg,可确保中国西葫芦的食用安全性。

湖北和广西辣椒脉斑驳病毒的检测及遗传多样性分析

【目的】研究辣椒脉斑驳病毒(Pepper veinal mottle virus,PVMV)的分布及遗传变异,为明确该病毒在我国的流行扩散分子机制提供理论依据。【方法】利用特异性引物反转录PCR(RT-PCR)检测从湖北宜昌及广西南宁和百色采集的48份疑似感染PVMV的辣椒样本;采用常规Sanger测序测定PCR产物序列,序列采用MEGA 5.0构建系统发育进化树,采用RDP等算法分析其可能的重组事件;采用DnaSP v5分析病毒株系不同群体之间的基因流及基因差异。【结果】从48份辣椒样本中检测到5份样本被PVMV侵染,检出率10.42%。基因同源性比对分析结果表明,测定的PVMV湖北和广西分离物CP基因序列同源性在97.00%以上,与其他地区分离物的同源性为91.73%~98.78%。系统发育分析表明,湖北(YC)和广西(NN)PVMV分离物与我国台湾PVMV分离物的亲缘关系最近。重组分析表明,PVMV广西分离物NN10有2个重组事件。【结论】湖北和广西辣椒的PVMV检测结果表明,该病毒已扩散至湖北和广西;基因突变可能是PVMV湖北分离物遗传变异的主要方式之一;而基因重组和基因突变可能是PVMV广西分离物遗传变异的重要因子。

辣椒脉黄病毒P4蛋白多克隆抗体制备与应用

【目的】辣椒脉黄病毒(Pepper vein yellows virus,PeVYV)属马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus),生产上主要侵染辣椒,目前在我国呈现快速扩展态势,因此,亟需开展PeVYV致病性研究,为分析对辣椒的潜在威胁提供依据。以PeVYV编码运动蛋白P4为免疫源,制备多克隆抗体,建立PeVYV P4蛋白特异性检测方法,为PeVYV P4蛋白功能研究奠定基础。【方法】采用RT-PCR技术,从感染PeVYV辣椒cDNA中扩增获得片段大小为471 bp的PeVYV P4基因,并克隆到原核表达载体pDEST17,转化E.coli Rosetta中进行诱导表达,采用Ni-NTA柱层析纯化。以纯化P4蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。制备的多克隆抗体采用Western blotting检测。【结果】原核表达的PeVYV P4蛋白,SDS-PAGE表明纯化蛋白为一分子量约为25 kDa的单一条带。Western blotting检测表明,制备的多克隆抗体,特异性的结合P4蛋白。PeVYV侵染辣椒样本检测表明,制备的P4多克隆抗体能特异性检测PeVYV。【结论】制备的PeVYV P4多克隆抗体,可用于特异性检测PeVYV P4蛋白,为进一步深入研究P4蛋白的功能奠定基础。

辣椒斑驳病毒CP蛋白多克隆抗体制备与应用

【目的】辣椒斑驳病毒(Pepper mottle virus,PepMoV)是近年来生产上主要侵染辣椒的新发病毒之一,目前有在我国快速扩展的趋势,因此,亟需开展该病毒的特异性快速检测技术,为明确该病毒在我国辣椒主产区的分布、发生致害规律及机制等研究提供科学手段。本研究以PepMoV编码的外壳蛋白CP为免疫源,制备特异性多克隆抗体,建立PepMoV的特异性快速检测方法,为PepMoV的分布和发生致害规律等研究奠定基础。【方法】采用特异性RT-PCR技术,从感染PepMoV辣椒的cDNA中扩增获得片段大小为822 bp的CP基因,并克隆到原核表达载体pET28α,转化E coli DH5α中进行诱导表达,采用Ni-NTA柱层析纯化。以纯化的重组CP蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备特异性多克隆抗体。制备的多克隆抗体采用ID-ELISA和Western blotting检测。【结果】获得原核表达的PepMoV重组CP蛋白,SDS-PAGE结果表明纯化蛋白为分子量约为37 kDa的单一条带。Western blotting和IDELISA检测结果表明,制备的多克隆抗体特异性高,仅识别PepMoV CP蛋白,不识别寄主蛋白和其他选择的马铃薯Y病毒;田间样本检测结果表明,PepMoV在湖南和贵州辣椒上的检出率为20.00%和43.33%。【结论】基于PepMoV CP蛋白特异性多克隆抗体建立的PepMoV快速检测方法,可为进一步深入研究该病毒在我国的分布和发生规律提供科学手段,也为该病毒CP蛋白的功能研究奠定基础。

降解甲氰菊酯光合细菌的分离鉴定及其降解特性研究

采用富集分离法从农药厂污泥中分离到一株能降解甲氰菊酯(fenpropathrin)的光合细菌新菌株PSB07-15,通过形态特征、生理生化特征以及对16SrDNA序列(Genbank Accession No.EU005383)进行了同源比较、鉴定。结果表明,该菌株为沼泽红假单孢菌(Rhodopseudomonas palustris)。生长特性和甲氰菊酯降解实验结果表明,该菌株的最适生长温度为30℃,最适pH为6.5。该菌以共代谢方式降解甲氰菊酯,对甲氰菊酯的最高耐受浓度为600mg·L-1,培养15d对600mg·L-1甲氰菊酯降解率达35.26%。通过GC-MS对降解产物进行了分析,结果显示间苯氧基苯乙腈是展出惟一的降解产物,推测该菌的降解途径是可能作用于甲氰菊酯的酯键处。本研究工作为利用光合细菌进行生物修复提供了理论依据。