紫菀酮对体外破骨细胞分化和活性的影响及作用机制研究

目的:探讨紫菀酮对体外破骨细胞分化和活性的影响及作用机制。方法:①分析紫菀酮对核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factorκB ligand,RANKL)诱导Raw 264.7细胞向破骨细胞分化的影响。将Raw 264.7细胞分为空白对照组、阳性对照组、紫菀酮1μmol·L^(-1)干预组、紫菀酮2.5μmol·L^(-1)干预组、紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组,空白对照组加入完全培养基,阳性对照组加入含25 ng·mL^(-1)RANKL的完全培养基,其余各组分别加入含有相应浓度紫菀酮及25 ng·mL^(-1)RANKL的完全培养基,培养5 d后进行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistant acid phosphatase,TRAP)染色,统计各组破骨细胞数;②分析紫菀酮对Raw 264.7细胞活力的影响。将Raw 264.7细胞分为空白对照组、紫菀酮1μmol·L^(-1)干预组、紫菀酮2.5μmol·L^(-1)干预组、紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组,空白对照组加入完全培养基,其余各组分别加入含有相应浓度紫菀酮的完全培养基,分别培养48 h、120 h后测定各组细胞活力;③分析紫菀酮对破骨细胞纤维状肌动蛋白环形成的影响。将Raw 264.7细胞分为空白对照组、阳性对照组、紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组,空白对照组加入完全培养基,阳性对照组加入含25 ng·mL^(-1)RANKL的完全培养基,紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组分别加入含有相应浓度紫菀酮及25 ng·mL^(-1)RANKL的完全培养基,培养5 d后采用鬼笔环肽和4’,6二脒基2苯基吲哚染色,观察各组破骨细胞纤维状肌动蛋白环形成情况。④分析紫菀酮对核因子κB(nuclear factorκB,NFκB)转录活性的影响。将稳定转染pGL4.32[luc2P/NFκBRE/Hygro]载体的RAW 264.7细胞分为空白对照组、阳性对照组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组,空白对照组及阳性对照组加入完全培养基,紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组加入终浓度为10μmol·L^(-1)紫菀酮的完全培养基;培养2 h后,阳性对照组及紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组分别加入RANKL溶液,使培养基中RANKL的终浓度为25 ng·mL^(-1);继续培养6 h后,检测各组细胞荧光素酶的荧光强度。⑤分析紫菀酮对核因子κB抑制蛋白激酶α亚基(inhibitor of nuclear factor kappaB kinase subunitα,IκBα)蛋白表达的影响。将Raw 264.7细胞分为阳性对照组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组,每组6孔,分别编号1~6。待细胞贴壁后,阳性对照组加入完全培养基,紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组加入终浓度为10μmol·L^(-1)紫菀酮的完全培养基,继续培养2 h后,在2组的1号孔加入RANKL溶液使RANKL终浓度为25 ng·mL^(-1),在1号孔加入RANKL溶液后30 min、40 min、50 min、55 min,分别在2号、3号、4号、5号孔加入RANKL溶液至RANKL终浓度为25 ng·mL^(-1)。在1号孔加入RANKL后60 min,收集各孔细胞,采用蛋白印迹法检测IκBα蛋白的表达量。⑥分析紫菀酮对破骨细胞特异性基因转录的影响。将Raw 264.7细胞分为阳性对照组、紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组。阳性对照组加入含25 ng·mL^(-1)RANKL的完全培养基,紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组分别加入含有相应浓度紫菀酮和25 ng·mL^(-1)RANKL的完全培养基,培养5 d后,收集各组细胞,采用实时定量PCR检测组织蛋白酶K、空泡型ATP酶d2亚基(vacuolar ATPase subsnit D2,VATPase d2)、TRAP的mRNA表达量。⑦分析紫菀酮对活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1,NFATc1)蛋白表达的影响。将Raw 264.7细胞分为阳性对照组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组,每组4孔,分别编号1~4。待细胞贴壁后,阳性对照组加入完全培养基,紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组加入终浓度为10μmol·L^(-1)紫菀酮的完全培养基。继续培养2 h后,在2组的1号孔加入RANKL溶液使RANKL终浓度为25 ng·mL^(-1),在1号孔加入RANKL溶液后2 d、4 d,分别在2号、3号孔加入RANKL溶液使RANKL终浓度为25 ng·mL^(-1)。在1号孔加入RNAKL后5 d,收集各孔细胞。采用蛋白印迹法检测NFATc1蛋白的表达量。结果:①紫菀酮对RANKL诱导Raw 264.7细胞向破骨细胞分化影响的分析结果。空白对照组之外的5组破骨细胞数比较,差异有统计学意义[(187.667±14.503)个,(180.000±14.422)个,(174.333±11.060)个,(152.667±5.033)个,(130.667±11.015)个,F=11.767,P=0.001]。紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组、紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组破骨细胞数均少于阳性对照组、紫菀酮1μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮2.5μmol·L^(-1)干预组(P=0.004,P=0.000;P=0.017,P=0.000;P=0.047,P=0.001);紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组破骨细胞数少于紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组(P=0.044)。②紫菀酮对Raw 264.7细胞活力影响的分析结果。紫菀酮干预48 h、120 h时,5组Raw 264.7细胞活力比较,组间差异均无统计学意义(48 h:0.960±0.101,0.938±0.051,0.916±0.072,0.915±0.079,1.009±0.105,F=0.647,P=0.641;120 h:1.347±0.161,1.388±0.047,1.423±0.473,1.398±0.067,1.357±0.034,F=0.400,P=0.805)。③紫菀酮对破骨细胞纤维状肌动蛋白环形成影响的分析结果。与空白对照组比较,阳性对照组、紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组均可见破骨细胞和纤维状肌动蛋白环;与阳性对照组比较,紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组破骨细胞纤维状肌动蛋白环形成均受到抑制,且其受到抑制的程度随紫菀酮干预浓度增加而增强。④紫菀酮对破骨细胞NFκB转录活性影响的分析结果。3组荧光素酶相对荧光强度比较,组间差异有统计学意义(0.058±0.003,1.000±0.044,0.753±0.040,F=613.132,P=0.000)。阳性对照组和紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组的荧光素酶相对荧光强度高于空白对照组(P=0.000,P=0.000),紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组的荧光素酶荧光强度低于阳性对照组(P=0.000)。⑤紫菀酮对IκBα蛋白表达影响的分析结果。2组破骨细胞IκBα蛋白相对表达量随诱导时间延长均呈先下降后上升趋势,但2组的趋势不完全一致(1.000±0.000,0.414±0.171,0.285±0.104,0.132±0.021,0.157±0.038,0.802±0.066,F=49.839,P=0.000;0.980±0.130,0.632±0.102,0.347±0.037,0.302±0.070,0.546±0.142,1.502±0.345,F=21.435,P=0.000);诱导20 min、30 min、60 min,紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组破骨细胞IκBα蛋白相对表达量高于阳性对照组(t=-4.018,P=0.016;t=-4.586,P=0.010;t=-3.444,P=0.026)。⑥紫菀酮对破骨细胞特异性基因转录影响的分析结果。3组破骨细胞VATPased2、组织蛋白酶K、TRAP的mRNA表达量比较,组间差异均有统计学意义(1.000±0.089,0.879±0.100,0.530±0.054,F=25.553,P=0.001;1.000±0.030,0.725±0.153,0.719±0.111,F=6.293,P=0.034;1.000±0.326,0.834±0.030,0.656±0.327,F=88.003,P=0.000)。紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组破骨细胞组织蛋白酶K、TRAP的mRNA表达量均低于阳性对照组(P=0.023,P=0.001);紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组破骨细胞VATPased2、TRAP的mRNA表达量均低于紫菀酮5μmol·L^(-1)干预组和阳性对照组(P=0.000,P=0.002;P=0.000,P=0.000);紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组破骨细胞组织蛋白酶K的mRNA表达量低于阳性对照组(P=0.021)。⑦紫菀酮对NFATc1蛋白表达影响的分析结果。2组破骨细胞NFATc1蛋白相对表达量随诱导时间延长均呈上升趋势,但2组的上升趋势不完全一致(1.000±0.000,1.175±0.007,4.700±0.742,19.430±1.763,F=250.352,P=0.000;1.042±0.035,1.334±0.290,3.531±0.583,15.690±0.823,F=525.669,P=0.000);诱导后5 d,紫菀酮10μmol·L^(-1)干预组破骨细胞NFATc1蛋白相对表达量低于阳性对照组(t=3.329,P=0.029)。结论:紫菀酮能够抑制体外破骨细胞的分化和活性,其作用机制与抑制NFκB和NFATc1信号通路有关。

霉酚酸酯联合环磷酰胺与环磷酰胺单药诱导治疗狼疮性肾炎的效果对比

目的前瞻性观察激素联合霉酚酸酯(MMF)和环磷酰胺(CYC)(多靶点组)诱导治疗狼疮性肾炎(LN)的疗效及安全性,并与传统的激素联合环磷酰胺静脉冲击疗法(IVCY组)进行比较。方法 50例经肾活检确诊为Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅲ+Ⅴ型和Ⅳ+Ⅴ型的LN患者随机分为多靶点组(n=25)和传统的IVCY组(n=25),两组患者均使用口服泼尼松1 mg/kg开始并逐渐减量。在多靶点组中MMF的剂量为1 g/d,MMF血药浓度(MPAAu C0-12h)目标值为20~30 mg·h/L;CYC剂量为每2周0.6 g静脉滴注,共6次。IVCY组中CYC剂量为每月1次静脉滴注1.0 g,共6次。诱导治疗疗程6个月。疗效观察的主要指标为完全缓解率,比较两组的疗效和不良反应。结果多靶点组与IVCY组的基线特征与临床指标差异无统计学意义,多靶点组在诱导3个月时(44.0%vs16.0%,P<0.05)和6个月时(72.0%vs 44.0%,P<0.05)的完全缓解率均显著高于IVCY组。对于Ⅳ+Ⅴ型LN,多靶点组的完全缓解率显著高于IVCY组(70.0%vs 25.0%,P<0.05)。多靶点组达到完全缓解所用时间显著短于IVCY组[(17.55±9.53)周vs(24.13±9.92)周,P<0.05]。诱导6个月时多靶点组的24 h尿蛋白下降幅度显著大于IVCY组[(86.8±20.9)%vs(66.7±30.5)%,P<0.01]。多靶点组与IVCY组总不良反应相当(28.0%vs 52.0%,P>0.05),其中多靶点组的主要不良反应为胃肠道不适(8%)和感染(12%),IVCY组的主要不良反应为胃肠道不适(16%)、感染(16%)、脱发(8%)和月经紊乱(8%),两组患者无一例死亡。结论激素联合MMF与CYC组成的多靶点疗法治疗LN疗效优于传统CYC单药疗法,尤其对Ⅴ+Ⅳ型LN疗效显著且不良反应发生率低,且多靶点组在早期诱导缓解LN疗效显著。多靶点疗法的临床疗效和对远期预后的影响还需要大样本多中心和长期随访的临床研究。

麦考酚吗乙酯联合来氟米特与麦考酚吗乙酯单药维持治疗狼疮肾炎的疗效对比

目的比较麦考酚吗乙酯(MMF)联合来氟米特与MMF单药维持治疗狼疮肾炎的疗效和安全性。方法收集经诱导治疗达到完全缓解或部分缓解后的44例Ⅲ~Ⅴ型狼疮肾炎患者临床资料,按其治疗方案分为多靶点组21例与单药组23例,2组在相同的综合治疗基础上,多靶点组予MMF 0.5 g每日2次联合来氟米特10 mg/d,单药组予MMF 0.5 g每日2次,总观察时间18个月,比较治疗前后疗效(主要观察终点为肾脏复发)及安全性。结果 2组治疗后均未出现死亡和终末期肾病患者。多靶点组维持治疗狼疮肾炎的无复发生存率高于单药组(95%vs.70%,P<0.05)。多靶点组完全缓解率高于单药组(81%vs.44%,P<0.05),且多靶点组患者维持治疗后完全缓解率高于治疗前(81%vs.24%,P<0.01),单药组治疗前后完全缓解率比较差异无统计学意义(35%vs.44%,P>0.05)。2组患者的不良反应以感染及胃肠道症状最为常见,组间不良反应发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 MMF联合来氟米特多靶点维持治疗狼疮肾炎预防肾脏复发和维持肾脏完全缓解均优于MMF单药治疗。

猫眼草黄素对破骨细胞分化及自噬作用的研究

目的研究猫眼草黄素对破骨细胞分化的影响及自噬在其中的作用。方法采用核转录因子-κB受体活化因子配体(RANKL)诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7分化成破骨细胞,空白组给予完全培养基,模型组给予含50.0 ng/mL RANKL的培养基,A~F组给予不同水平猫眼草黄素(0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L)+含50.0 ng/mL RANKL的培养基。染色后计数破骨细胞数目,同时通过Western blot检测自噬相关蛋白LC3、ATG5的表达情况。结果C~F组破骨细胞数量与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较,模型组及B、D、E组中自噬相关蛋白ATG5表达未见明显变化(P>0.05)。与空白组比较,模型组自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加(P<0.05)。与模型组比较,B、D、E组自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P<0.05)。与模型组比较,猫眼草黄素干预1、3、5 d时,自噬相关蛋白ATG5表达无明显变化(P>0.05)。在干预3、5 d时,自噬相关蛋白LC3的表达较模型组明显下降(P<0.05)。结论猫眼草黄素对破骨细胞的分化有抑制作用,且呈剂量依赖性,其可能通过自噬途径发挥抑制作用。