锥虫早老素蛋白亲水区的克隆和表达纯化

目的体外表达锥虫早老素蛋白亲水区肽段,以制备抗血清用于功能研究。方法根据锥虫早老素蛋白二级结构特性,设计引物分别扩增N端及C端片段的亲水区肽段基因,装入原核表达载体进行表达,并通过变性纯化方法获得足够量表达蛋白,制备兔抗血清。结果成功扩增并克隆锥虫早老素蛋白亲水区片段L2及L7,并分别采用变性磁珠法和变性树脂法进行大量蛋白产物纯化,浓缩纯化产物制备兔抗血清经Western blot杂交验证,出现目的蛋白大小阳性条带。结论成功表达锥虫早老素蛋推测N端及C端亲水肽段,并成功制备抗血清,可用于锥虫早老素蛋白功能分析。

酵母双杂交筛选锥虫早老素蛋白相互作用蛋白

目的筛选寻找锥虫早老素蛋白相互作用蛋白,以了解锥虫早老素蛋白功能。方法体外表达锥虫早老素蛋白片段,装入pGBKT7诱饵质粒,与随机肽库系统共转化酵母,筛选阳性克隆并测序,通过与基因库锥虫功能序列比较,推导可能的相互作用蛋白。结果获得108个阳性克隆,对其中50个进行了序列测定和比较,获得最有可能的4个候选基因,分别为:丝/苏氨酸性磷酸酶2b催化亚基A2;钙激活蛋白,含锚蛋白重复序列蛋白以及一个具有与APP跨膜区结合位点特征序列的功能未知蛋白。结论成功利用随机肽库酵母双杂交系统筛选锥虫早老素蛋白相互作用基因,其相互作用仍有待进一步确认。