高通量筛选酸敏感离子通道1a抑制剂研究

目的建立体外稳定过表达酸敏感离子通道1a(ASIC1a)的Fisher大鼠甲状腺上皮细胞(FRT细胞),采用Ca^(2+)敏感荧光染料Fura-2/AM和细胞毒性检测〔乳酸脱氢酶(LDH)释放法〕测定ASIC1a活性,探讨高通量筛选ASIC1a抑制剂的可行性。方法2014年1月—2016年2月,利用分子生物学方法,构建ASIC1a过表达载体pc DNA3.1/myc-His-m ASIC1a,通过细胞转染技术建立了稳定过表达ASIC1a的Fisher大鼠FRT细胞。将细胞分成两组,对照组(FRT细胞)和实验组(稳定过表达ASIC1a的FRT细胞),并分别未负载和负载Ca^(2+)敏感荧光染料Fura-2/AM,采用酶标检测仪测定双波长(340 nm和380 nm)的值,计算F340/F380。对照组和实验组细胞经不同p H值酸液(p H值7.5、7.0、6.5、6.0、5.5)刺激后,采用酶标检测仪测定450 nm波长处LDH释放量。结果对照组与实验组未负载Fura-2/AM细胞F340/F380比较,差异无统计学意义(P>0.05);实验组负载Fura-2/AM细胞F340/F380较对照组升高(P<0.05);对照组和实验组负载Fura-2/AM细胞F340/F380较未负载Fura-2/AM细胞升高(P<0.05)。p H值6.5、6.0、5.5时,实验组细胞LDH释放量大于对照组(P<0.05);对照组和实验组细胞不同p H值时LDH释放量比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论本研究成功建立稳定过表达ASIC1a的FRT细胞,Ca^(2+)敏感荧光染料Fura-2/AM和细胞毒性检测(LDH释放法)两种方法测定ASIC1a活性,使高通量筛选ASIC1a抑制剂成为可能,为发现高选择性和高活性的天然小分子ASIC1a抑制剂奠定了基础。

NMDA受体亚单位NR2D与MOCA相互作用的鉴定

目的:寻找N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体亚单位NR2D的结合蛋白,为探讨NR2D在视网膜兴奋性毒性损伤中的作用提供依据。方法:构建了包含NR2D细胞内C末端的cDNA片段为诱饵质粒,应用酵母双杂交技术筛选小鼠脑cDNA文库,并用免疫共沉淀实验进一步验证NR2D与其结合蛋白之间的相互作用,免疫荧光显微镜观察NR2D和目的蛋白在视网膜中的共表达。结果:酵母双杂交筛选到细胞黏附修饰因子(modifier of cell adhesion,MOCA)为NR2D可能的相互作用蛋白,两者在视网膜有共定位。结论:MOCA能特异结合谷氨酸受体NR2D,这为进一步研究谷氨酸的兴奋性毒性参与视网膜退行性变的机制奠定了实验基础。

水通道蛋白AQP5对小鼠骨髓间充质干细胞分化能力的影响

目的探寻水通道蛋白5(Aquaporin 5,AQP5)对小鼠骨髓间充质干细胞分化能力的影响。方法采用RT-PCR和Western Blot方法检测AQP5在小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达。定向诱导BMSCs后分别进行油红O染色(成脂),茜素红S和碱性磷酸酶染色(成骨),Collagen II和番红素O染色(成软骨)。检测钙离子、碱性磷酸酶和胞外糖胺多糖含量,Real-time PCR检测成脂、成骨和成软骨分化后的特异标记分子的相对+/+m RNA表达。结果 RT-PCR和Western Blot结果发现野生型(AQP5)BMSCs中有AQP5阳性条带。油红O、茜素红S、碱-/-性磷酸酶,Collagen II和番红素O染色阳性染色率在AQP5敲除型(AQP5)BMSCs明显高于野生型。Real-time PCR结果证-/-实AQP5 BMSCs在成脂、成骨和成软骨分化特异标记分子的相对m RNA表达水平显著提高。结论小鼠BMSCs中有AQP5表达,AQP5敲除显著提高BMSCs的成脂、成骨和成软骨分化能力。

DNA损伤修复反应的双刃剑效应在肿瘤与衰老发生发展中的作用

人类生存环境中的有害物质、机体正常代谢产生的氧化自由基、端粒缩短或端粒酶活性改变、原癌基因激活或抑癌基因失活等均可造成DNA损伤。通过启动DNA损伤修复反应,激活p53/p21或p16/Rb信号转导途径可以引发细胞周期阻滞,为修复破损的DNA赢得时间,避免不完整的DNA信息继续传递下去。过度的细胞周期阻滞将引起不可逆的细胞增殖停滞并最终引起细胞衰老,而当损伤的DNA没有完全修复就无限制的进入细胞周期时,将会诱发肿瘤的形成。肿瘤和衰老的发生机制是相互对立、相互交织的,而DNA损伤修复反应是联系二者的纽带。

麦普替林对黑色素瘤A375细胞转移和侵袭的影响

目的研究新型抗癌药物麦普替林对人源黑色素细胞瘤A375细胞的作用,探讨其对黑色素细胞瘤治疗效果。方法应用不同浓度的麦普替林药物对A375细胞进行处理,比色定量法检测细胞的凋亡水平。在A375细胞中分别加入无菌水和麦普替林,进行划痕实验;利用Transwell实验,研究麦普替林对于黑色素瘤转移和侵袭的影响。结果麦普替林作用下A375细胞凋亡水平显著增加。划痕实验和Transwell实验显示,A375细胞加入麦普替林后,其增殖、迁移、侵袭的细胞数量都有显著的减少。结论麦普替林显著抑制黑色素瘤,具有良好临床应用前景。

SIRT2在神经退行性疾病中的研究进展

Sirtuins蛋白是一种NAD^+依赖性组蛋白去乙酰化酶,被认为具有抗癌症、糖尿病、心脑血管疾病和神经退行性疾病等衰老相关疾病的保护作用。在哺乳动物细胞内已经发现了7种不同类型的Sirtuins蛋白,分别命名为SIRT1-7,显示出在亚细胞定位和功能上的多样性。其中SIRT2蛋白对阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病等神经退行性疾病具有促进作用,而SIRT2抑制剂具有神经保护作用。

染色体结构维持蛋白SMC1对细胞多极的影响

目的研究染色体结构维持蛋白SMC1不同表达水平对细胞多极形成的影响。方法分别采用分子生物学和慢病毒包装的方法建立稳定过表达SMC1和稳定沉默SMC1 (shSMC1)-HCT116细胞系,而后用Western Blot的方法检测稳定细胞株的构建是否成功,最后应用免疫荧光方法检测过表达与低表达SMC1两种情况对细胞多极分裂的影响。结果 Western blot及免疫荧光结果显示HCT116细胞在过表达SMC1与低表达SMC1两种情况与正常HCT116细胞相比均显著增加了细胞多极的比例且有统计学意义(P<0.05)。结论 SMC1与细胞的多极行为密切相关,对基因组稳定性的维持发挥了重要作用。