一例从国内鹦鹉鉴定到鹦鹉博尔纳病毒2型的诊断研究

为探究一例非洲灰鹦鹉死亡原因。本研究通过临床症状、病理变化以及分子检测等方法对一例非洲灰鹦鹉的死因进行了分析诊断。该鹦鹉生前即出现食欲下降、精神萎靡和呕吐等症状,死后剖检观察到腺胃扩张且胃内有未消化食物并伴酸臭味,胃壁变薄,脑部充血等现象,通过病理切片及分子诊断显示,该鹦鹉感染了博尔纳病毒。通过测序及进化树分析表明,该鹦鹉感染的博尔纳病毒为鹦鹉博尔纳病毒2型,为国内首次发现。本研究为该病毒的诊断提供了依据,并为该病的防控提供了参考。

一种复方麻醉剂对圈养马来熊麻醉效果的研究

为了探索一种适合熊科动物使用的理想复合麻醉药物,该研究采用TMZB(布托啡诺-右美托咪啶-替来他明-唑拉西泮)复合麻醉药物以0.20-0.30 mg/kg的剂量对10只圈养马来熊采用肌肉注射的方式进行全身麻醉。并对麻醉后动物的镇痛效果、镇静效果、肌松效果、苏醒效果及各项生理机能进行观察和评分。结果显示:麻醉动物的肌松、镇静、镇痛效果良好,麻醉后动物体温、呼吸率、心率、血氧饱和度、平均动脉压与原基础值相比,均差异不显著。研究表明:TMZB组合是一种理想的熊科动物复合麻醉药物,为熊科动物的饲养管理、疾病诊断、手术治疗等提供较好的保定、麻醉、镇静、镇痛及肌肉效果,且麻醉效果稳定。

华南虎源乳酸菌的分离筛选及体外益生特性

乳酸菌对动物肠道健康具有非常重要的作用。为了筛选出具有益生特性的优良菌株,对健康华南虎(Panthera tigris amoyensis)粪便中的乳酸菌进行分离培养、纯化及鉴定,并通过研究菌株对大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella sp.)和迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的抑菌性及菌株的耐酸、耐胆盐、溶血性和对24种药敏纸片的耐药性,对菌株生物学特性进行评价。结果显示:共分离得到78株乳酸菌,其中15株具有较好的抑菌性能,对以上4种致病菌的抑菌圈均大于15 mm,含6株罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri,22YY08、22DC20、22XX19、22Hui09、22LL14和22XX03)、3株卷曲乳杆菌(L. crispatus,22HH02、22YY13和22YY09)、2株动物乳杆菌(Ligilactobacillus animalis,22Hui15、22LL07)、1株戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus,22DC18)、1株黏膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae,22DC10)、1株约氏乳杆菌(L. johnsonii,22DC09)和1株格氏乳球菌(Lactococcus garvieae,GaL110)。通过进一步试验筛选出8株乳酸菌,在pH=2.5和胆盐浓度为0.1%时表现出较好的耐酸、耐胆盐性能,均不产生溶血性,但其中3株罗伊氏乳杆菌22Hui09、22YY08和22LL14对多种药物耐药,其他菌株对多种药物敏感。本试验筛选获得的3株罗伊氏乳杆菌(22DC20、22XX03和22XX19)、1株戊糖片球菌(22DC18)和1株格氏乳球菌(GaL110)有希望作为具有益生特性的菌株应用到华南虎益生菌制剂的开发。

小熊猫源铜绿假单胞菌耐药性和耐药基因的研究

为了鉴定小熊猫(Ailurus fulgens)肺源致病菌并研究其耐药性和耐药基因,从死亡小熊猫肺部组织中无菌分离培养致病菌,进行革兰氏染色及16S rDNA测序鉴定。采用纸片扩散法(K-B法)进行细菌药敏试验和小鼠致病性试验,应用PCR法检测分离株的28种β-内酰胺酶相关基因、6种氨基糖苷类修饰酶基因(AMEs)、外膜蛋白D2基因(oprD2)、磺胺耐药基因(qacE△1-sul1)、3种整合子基因(intⅠ1、2、3)和主动外排泵调节基因(mexR)等共40种耐药基因。肺组织样品中分离培养的1株菌鉴定为铜绿假单胞菌,革兰氏染色阴性,药敏试验对氯霉素敏感,对β-内酰胺类、头孢类、氨基糖甙类、大环内酯类、硝基咪唑类、喹诺酮类和利福霉素等均具有耐药性,小鼠表现与小熊猫相似的症状而死亡。5种耐药基因TEM、aac(3)-Ⅱ、ant(3″)-Ⅰ、qacE△1-sul1、intⅠ1为阳性,其他35种为阴性。该小熊猫肺源铜绿假单胞菌具有较强的致病性和多药耐药性,其耐药机制与5种耐药基因有关。

东北虎γ-干扰素基因的克隆、生物信息学分析及其在毕赤酵母中的表达

本试验旨在通过克隆东北虎γ-干扰素(IFN-γ)基因,研究其分子特征并预测蛋白生物学功能,为后续研究干扰素抗病毒活性做前期准备。通过RT-PCR从ConA诱导过的东北虎血淋巴细胞中扩增东北虎IFN-γ基因并测序,应用生物信息学方法进行序列分析。结果表明:东北虎IFN-γ编码区由504个核苷酸组成,共编码167个氨基酸,蛋白相对分子质量为19.59 ku,等电点为9.03,所编码的蛋白为碱性亲水性蛋白,其中前23个氨基酸可能为信号肽,IFN-γ编码蛋白保守结构域为IFN-γ超家族,且存在跨膜结构,其中1-6位氨基酸为胞内区域,7-28位氨基酸为跨膜区域,29-167位氨基酸为胞外区域;IFN-γ编码蛋白二级结构主要以α-螺旋(58.08%)和无规则卷曲(33.53%)为主,存在5个潜在的B细胞抗原表位,3个潜在的N-糖基化位点;分子进化分析显示,东北虎IFN-γ与GenBank上发表的东北虎、非洲狮、金钱豹、美洲狮、猎豹、家猫、加拿大猞猁、野猪等的核苷酸相似性为80.4%~99.8%,氨基酸相似性为70.5%~100%,东北虎IFN-γ与非洲狮、金钱豹亲缘关系最近,美洲狮、猎豹、家猫、猞猁次之,野猪最远。通过合成改造后的东北虎IFN-γ基因,构建能表达IFN-γ蛋白的重组质粒pPIC9K-IFN-γ,将其导入高效表达系统-毕赤酵母中进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达蛋白的分子量约17.8 ku,与预期大小相符,表明东北虎IFN-γ成功表达。

小熊猫源犬瘟热病毒株H、F基因的克隆及序列分析

为了解1株圈养小熊猫源犬瘟热病毒(CDV)GD-1的遗传变异情况,通过RT-PCR方法对该株CDV进行H、F基因的克隆、测序及序列分析。结果显示:该分离株的H基因序列与GenBank中丹麦报道的登录号为GU266280的犬源CDV毒株的核苷酸序列相似性最高,为96%;F基因序列与巴西报道的登录号为KY057355的犬源CDV的核苷酸序列相似性最高,为95.7%。下载CDV代表毒株序列进行遗传演化、氨基酸序列比对及分子特征分析。结果显示:H蛋白共有8个潜在的N-糖基化位点,分别位于19、149、309、391、422、456、587、603位点;H蛋白的SLAM受体结合位点氨基酸序列与欧亚野生型毒株一致,与疫苗株相比,530、549位氨基酸不同,与其他CDV参考毒株H蛋白相比还存在24、41等9处氨基酸位点发生明显变异,与标准强毒株A75/17的氨基酸相似性为95.2%,与Onderstepoort、Convac等5株疫苗株的氨基酸序列相似性为88.2%~89.3%;F蛋白共有6个N-糖基化位点,分别位于62、108、141、173、179、517位,与Onderstepoort等疫苗株氨基酸相似性为89.1%~89.7%;与其他参考毒株相比还存在115、130等11处氨基酸发生变异;构建基于H、F基因的遗传进化树,结果显示:该毒株位于Asia-4型的一个小的进化分支,这与目前我国流行毒株主要位于Asia-1型存在明显不同。本研究首次报道了小熊猫源的Asia-4基因型CDV野毒株,并对毒株的H及F基因进行了序列分析,对于了解我国CDV流行株的遗传变异情况、流行病学调查、疾病防控及疫苗研发等具有重要意义。

狮源猫细小病毒分离鉴定及其VP2基因序列分析

为对疑似感染猫细小病毒的非洲狮进行确诊,了解猫细小病毒的流行特点,通过猫肾细胞(F81细胞)对非洲狮粪便样品进行病毒分离并通过PCR鉴定,对检测到的细小病毒进行VP2基因扩增和分析。结果显示:成功从非洲狮粪便中分离出1株细小病毒,将其命名为FPV CHN-HN-1。该病毒接种到F81细胞上,能使细胞出现拉丝、脱落现象。该分离株与参考的26株细小病毒分离株相似性为97.8%~100%,其中与分离株JN-FPV-96 (MZ836373.1)、TZ-FPV-112 (MZ836368.1)、FPV-SH2003 (MW811187.1)和 BJ051 (MT270580.1)相似性高达100%;与其他7株猫源细小病毒同属一个分支,与JN-FPV-96、TZ-FPV-112、FPV-SH2003、BJ051遗传距离最近,与其他参考毒株遗传距离较远。本研究为细小病毒病的诊断和治疗提供了依据,也为后期疫苗的研制打下了基础。

马来穿山甲源嗜水气单胞菌亚种的分离鉴定及生物学特性分析

为鉴定马来穿山甲(Manis javanica)腿部致病菌并研究其致病性、耐药性和耐药基因,从救护的1只马来穿山甲腿部溃烂处采集样品,无菌分离培养致病菌,进行形态学观察、革兰氏染色及16S rRNA和gyrB基因测序分析,并开展细菌药敏试验和小鼠致病性试验,随后通过PCR扩增6种毒力基因(rtxA、earA、hlyA、alt、act、epa)及19种耐药基因(5种β-内酰胺酶相关基因、6种氨基糖苷类修饰酶基因、6种氯霉素耐药基因、2种磺胺耐药基因)。结果显示:分离的1株优势菌为革兰氏阴性短杆菌,经16S rRNA和gyrB基因测序以及序列进化树分析鉴定为嗜水气单胞菌亚种(Aeromonas dhakensis),其gyrB基因序列与马来西亚分离株高度同源,推测此致病菌可能由非法走私的穿山甲从马来西亚携带至我国。药敏试验显示,其对头孢曲松、头孢克肟、庆大霉素和氧氟沙星等药物敏感,对青霉素、阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛、氯霉素、磺胺甲恶唑、甲氧苄啶和林可霉素耐药。4种耐药基因tem、aac(3)-II、flor、sul2为阳性,与抗生素耐药表型相符。4种毒力基因earA、hlyA、alt、act为阳性,小鼠半数致死量为3.75×10^(6 )CFU/mL。根据药敏结果使用敏感抗菌药物治疗穿山甲,其腿部患处有好转。因此,引起穿山甲腿部溃烂的病原嗜水气单胞菌亚种(Aeromonas dhakensis)可能为国外传入菌株,具有较强的致病性和多重耐药性。本研究为嗜水气单胞菌的流行病学调查及其感染的防治提供了依据。

广东地区猪伪狂犬病流行病学调查与gE、TK基因遗传进化分析

为了解广东地区猪伪狂犬病的流行与变异情况,于2014年11月至2015年2月期间从广东省不同地区的猪场所采集的640份血清样品进行PRV野毒检测,结果显示,广东省的血清阳性率超过25%。针对PRV g E基因设计一对特异性引物,对来100份病料进行PCR鉴定。对筛选为阳性的病料分别进行g E主要抗原表位序列和TK全基因扩增,分别得到约800 bp和1000 bp大小的特异性目的条带并将其测序。利用DNAstar和MEGA软件将测序结果与国内外已发表的序列进行遗传进化分析。结果表明,所得到的PRV毒株核苷酸序列有较高的同源性,且与国内流行毒株进化关系密切。

关于完善野生动物防疫检疫管理体系的思考

野生动物的防疫检疫管理对公共卫生安全至关重要。本文将梳理与野生动物防疫检疫管理相关的法律法规,并结合在实际防疫检疫执法过程中面临野生动物溯源困难、缺少检疫标识、滥食野生动物等问题,提出科学客观定义野生动物,完善野生动物防疫法及检疫规程,明确各执法部门职责,搭建圈养野生动物信息管理平台,支持野生动物疫源疫病研究和专用疫苗开发等建议,以期为完善野生动物的防疫检疫管理体系提供参考。

小反刍兽疫RT-PCR的鉴定及N基因序列分析

根据小反刍兽疫病毒(PPRV) P、N基因保守序列设计了两对引物,分别扩增部分P基因及N基因的全长阅读编码框(ORF),对疑似小反刍兽疫病毒的样品抽取RNA并以其为模板,在RT-PCR的体系中能扩增出预期大小分别为766 bp、1578 bp的目的片段,同时对退火温度,敏感性及特异性等RT-PCR反应条件进行了优化。在最佳反应条件下,该RT-PCR能检出最低850拷贝的PPRV基因组。对N全基因进行RT-PCR扩增并对PCR产物克隆于pMD-19T载体,转化感受态细胞DH5α后,对重组质粒测序,结果表明N基因全长大小与预期完全一致。并且这两个基因与新疆伊犁、北京所发生的小反刍兽疫病毒同源性高达100%,说明该病毒在中国南北方都有存在,其亚型为基因4型。

基于RASEF基因性别间序列变异的鹤鸵性别鉴定

双垂鹤鸵(Casuarius casuarius)是一种单态性鸟,从外观形态上很难准确区分其性别,对人工配对、繁殖和饲养造成了极大阻碍。本实验选取RASEF基因作为靶基因,利用其同源序列进行引物设计,对3只已知性别和11只未知性别鹤鸵进行PCR扩增和测序,根据RASEF基因序列中的SNP位点判断鹤鸵的性别。结果发现,在3个已知个体中,雄性个体扩增序列的第119、157和162位的基因型分别为纯合子G/G、T/T和C/C,雌性个体中则呈现杂合位点G/A、T/G、C/T。通过对11个未知性别鹤鸵进行鉴定,测序结果与形态学鉴定结果也一致。本研究基于分子方法成功地对鹤鸵的性别进行了准确的识别,建立了一种快速、简单、可靠的性别鉴定方法,从而解决鹤鸵幼鸟和亚成体难以区分性别的问题,也为今后鸟类性别的鉴定提供了一种参考。

虎源、小熊猫源副流感病毒5型的鉴定及F基因遗传进化分析

为探究副流感病毒5型（PIV5）的遗传变异状况，对PIV5的预防、诊断、治疗提供依据，于20142016年，收集疑似PIV5感染病例样品14份（小熊猫4份，非洲狮4份，东北虎1份，华南虎1份，环尾狐猴4份）做相应处理，接种VerO细胞并通过PcR检测，对检测到的PIV5的F基因进行扩增，连接目的片段至pMD19-T Simple Vector，测序并做序列分析。结果成功从华南虎、东北虎和小熊猫标本中分离出3株PIV5，分别命名为PIV5-SR，P1V5ST，ZJQ221。3株病毒接种到Vero细胞上，均能使Vero细胞出现空泡、拉网的现象。用相关软件分析该病毒F基因序列发现，3株病毒的F基因分别有5，6，4处突变；建立遗传进化树表明，3株病毒处同一分支，均与韩国犬源1168—1分离株亲缘关系最近。

鹦鹉源禽博尔纳病毒的鉴定及全基因序列分析

为了对疑似禽博尔纳病毒感染病例进行确诊,并了解鹦鹉源禽博尔纳病毒毒株的流行特点,本试验设计合成1对特异性引物,对疑似感染禽博尔纳病毒而死亡的鹦鹉进行检测,并设计7对首尾重叠的引物对其中1株确诊的博尔纳病毒全基因进行RT-PCR扩增、测序,应用DNAStar和MEGA6.06软件将本次获得的PaBV-4与GenBank上公布的PaBV序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,死亡的10只鹦鹉中,有5只感染PaBV-4,1只感染PaBV-5。选取其中1份PaBV-4组织样品做全基因测序和序列分析,结果显示PaBV-4基因组全长8915 nt,编码6种蛋白,与NM20分离株核苷酸相似性最高(99.6%),与6758分离株氨基酸相似性最高(99.8%);遗传进化分析显示,与PaBV-4各分离株M14、AG5、6758亲缘关系最近,同属一个小的分支,其次是NM01,与PaBV-5各分离株亲缘关系最远。

鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,通过扩增病毒M基因并与pMD19-T载体连接,构建重组质粒作为标准品,根据M基因序列设计特异性定量引物,进行了荧光定量PCR的敏感性、特异性、重复性试验。结果显示,荧光定量PCR比普通PCR检测灵敏度高100倍,可检出最低拷贝数为6.7×10^2 copies,μL的标准品,而普通PCR只能检测到最低拷贝数为6.7×10^4 copiesμL的标准品;用荧光定量PCR方法检测H5N6、H7N9、H9N2 AIV,NDV,IBV时均未见扩增;批内及批间重复变异系数均小于1%;对8只鹦鹉脑组织样品进行检测,荧光定量PCR检出阳性样品6份,普通PCR检出阳性样品4份,检出率两者相差25%。采用本方法对64份临床采集的鹦鹉粪便样本进行检测,结果筛选出阳性样品1份。以上结果表明,本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于鹦鹉博尔纳病毒4型的检测。