FOXA2改善肝内胆汁淤积伴高脂血症小鼠肝脏功能和血脂水平

目的研究叉头框蛋白A2(forkhead box A2,FOXA2)对肝内胆汁淤积伴高脂血症小鼠肝脏功能和血脂水平的调节作用。方法通过饲喂高胆固醇/胆酸饲料(cholic acid diet,CAD)构建小鼠模型,尾静脉高压注射法向小鼠肝脏内转染FOXA2质粒,使肝细胞过表达FOXA2蛋白。全自动血生化分析仪检测小鼠血清转氨酶、甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和胆汁酸水平,比色法检测肝脏内胆固醇水平,ELISA法检测肝脏胆汁酸水平。Western blot检测肝脏FOXA2的表达,RT-PCR检测胆汁酸代谢相关基因mRNA表达情况。HE、油红染色观察肝脏组织结构及脂质积累情况。结果随着CAD饲喂时间延长,小鼠体质量不断下降,胆囊明显增大(P<0.01),转氨酶水平升高、血清胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇明显升高(P<0.01),肝脏组织结构受损,肝脏胆固醇、胆汁酸水平升高(P<0.01),脂质累积严重。过表达FOXA2可通过调节肝脏胆汁酸代谢基因明显改善CAD饲喂小鼠肝功能和血脂异常,降低肝脏胆汁酸水平(P<0.01)和肝脏脂质积累。结论FOXA2改善肝内胆汁淤积伴高脂血症小鼠肝脏功能和血脂水平。

人肝细胞脂筏区蛋白质组学研究揭示肝活素新机制

肝活素(hepassocin, HPS)是一种重要的肝细胞活性因子,主要表达于肝组织,少量表达于胰腺。目前研究表明,肝活素通过非受体酪氨酸激酶(Src proto-oncogene, non-receptor tyrosine kinase, Src)/表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor, EGFR)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)途径诱导L02细胞增殖,小窝蛋白1(caveolin 1, CAV1)在肝活素刺激下调节L02细胞G1/S期细胞周期行进。但肝活素诱导细胞增殖的分子机制仍不明确。Src、EGFR和CAV1均定位在脂筏中。因此推测,肝活素可能通过脂筏发挥作用。本研究首先验证了一种快速有效的分离脂筏区蛋白质提取方法。基于此方法提取脂筏区蛋白质,以磷酸酪氨酸单克隆抗体(p-Tyr)进行免疫共沉淀分析,通过对人肝细胞脂筏区蛋白质组学研究和分析后,聚焦于信号传导与转录活化因子3(signal transducers and activators of transcription 3, STAT3)通路。Western印迹和间接免疫荧光结果表明,肝活素刺激可显著活化STAT3通路,促进STAT3入核,上调其下游靶基因MYD88天然免疫信号转导适配器(innate immune signal transduction adaptor, MYD88),蛋白酶体20亚基β8(proteasome 20S subunit beta 8, PSMB8), TRIM21 (tripartite motif containing 21)和内质网氨基肽酶1(endoplasmic reticulum aminopeptidase 1, ERAP1)(^****P<0.0001,^***P<0.001,^**P<0.01,^*P<0.05)的表达。分别抑制p-EGFR和Src后,肝活素对STAT3的活化作用消失。阻断STAT3通路明显抑制肝活素的促肝细胞增殖功能(^P<0.05)。综上所述,肝活素刺激可活化STAT3通路。本研究为肝活素的功能和作用机制提供新的线索。

肝活素(HPS)——一种新的小鼠急性肝损伤标志物

目的急性肝衰竭是目前临床上导致死亡的重要病因之一,研究具有肝特异性、灵敏度高的肝损伤标志物对于严重肝病的早期诊断以及预后预测具有重要的意义。肝活素(hepassocin,HPS)是一种具有高度组织特异性的促肝细胞增殖活性因子,在动物水平检测其在血清中的表达水平与肝损伤程度的相关性将为其开发成临床检测急性肝损伤的特异性标志物奠定基础。方法利用腹腔注射不同剂量CCl4处理诱导小鼠急性肝损伤模型,检测小鼠的存活率、转氨酶水平以及肝病理变化。通过ELISA检测小鼠血清的HPS水平;实时PCR法检测HPS mRNA水平;Western印迹法检测HPS的蛋白表达水平。结果随着CCl4处理剂量的增加,小鼠死亡率显著升高,肝损伤程度显著增加,在此过程中,HPS在小鼠血清及肝组织中的表达水平也显著上调,并与肝损伤程度密切相关。结论HPS可做为一种新的小鼠肝损伤标志物。

重组人肝活素(HPS)的制备及其对四氯化碳诱导肝细胞损伤的保护作用研究

目的肝活素(hepassocin,HPS)是一种具有促肝细胞生长,保护肝细胞免于损伤的肝特异性生长因子,研究其保护机制将为肝病的防治机制提供重要的实验依据。方法通过真核表达系统获得重组人HPS,通过Ed U掺入实验检测其活性。用四氯化碳(CCl4)建立肝细胞损伤模型,在此基础上用不同浓度HPS进行处理或干涉内源HPS,检测细胞上清中转氨酶、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽转移酶的变化。结果制备的HPS纯度达到95%以上,具有良好的促细胞增殖活性。10%CCl4处理可致肝细胞损伤,HPS处理可显著降低转氨酶及LDH水平,增加SOD及谷胱甘肽转移酶的水平;干涉HPS则显著增加转氨酶及LDH水平,降低SOD及谷胱甘肽转移酶的水平。结论 HPS可通过增强肝细胞的抗氧化能力减轻肝细胞损伤。

白细胞介素5改善CCl4诱导的小鼠急性肝损伤研究

目的研究白细胞介素5(IL-5)对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤(ALI)的保护作用。方法利用腹腔注射不同剂量CCl4,诱导小鼠ALI模型,并于损伤后24、36、48、72 h通过ELISA检测血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、IL-5的含量;计算血清中IL-5水平与ALT、AST之间的相关系数;在CCl4造模前24 h给小鼠腹腔注射重组IL-5蛋白100μg/kg,于损伤后24、36、48、72 h检测血清中ALT和AST水平以及肝组织中Caspase-3的活性;对肝组织进行HE、BrdU或Ki67免疫组化染色,统计肝组织坏死面积以及BrdU和Ki67阳性细胞比例。结果CCl4造模后24 h,小鼠血清中IL-5水平升高,并与肝损伤程度呈正相关;与对照组相比,IL-5组小鼠在CCl4造模24 h后ALT减少约63.2%(P<0.0001)、AST减少约59.6%(P<0.0001);CCl4造模后36 h小鼠肝坏死面积减少约45.8%(P<0.05);CCl4造模后48 h肝组织中Caspase-3活性下降64.3%(P<0.01);在CCl4造模后36、48 h小鼠肝BrdU、Ki67阳性细胞数目显著升高(P<0.01)。结论IL-5能改善CCl4介导的ALI以及促进肝损伤的修复过程。

MCFP敲除小鼠肝脏线粒体功能异常

目的研究线粒体载体家族蛋白(MCFP)基因敲除对小鼠肝脏线粒体功能的影响。方法利用CRISP/Cas9技术建立MCFP基因敲除小鼠模型,并检测小鼠体质量、脏器系数、血生化以及糖代谢情况。分离小鼠原代肝实质细胞检测线粒体膜电位。提取肝脏线粒体,检测三磷酸腺苷(ATP)、活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)水平,利用非变性凝胶电泳偶联凝胶内酶活染色,检测线粒体呼吸链复合体活性。结果与同窝对照小鼠相比,MCFP敲除小鼠生理指标无明显差异,但线粒体膜电位及ATP水平降低,呼吸链复合体活性下降、ROS升高、SOD活性下降、MDA含量增加。结论MCFP基因敲除造成肝脏线粒体功能异常,提示MCFP在线粒体抗氧化损伤及合成ATP过程中发挥重要调控作用。

非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型构建及基因表达谱分析

目的研究非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型小鼠肝脏基因表达谱变化,为NASH发生发展的分子机制及防治药物研发提供参考。方法甲硫氨酸(蛋氨酸)-胆碱缺乏(MCD)饲料喂饲C57BL/6小鼠构建NASH模型,分别于造模0、1、2、3周称量小鼠体质量,摘眼球取血,全自动生化仪检测血糖、转氨酶、甘油三酯、胆固醇及游离脂肪酸,脱颈活杀小鼠后摘取肝脏称重,肝组织HE染色,并用称重法检测肝脏甘油三酯。TRIzol提取造模0周和3周组小鼠肝脏总RNA并检测基因表达谱变化,对差异基因进行基因本体(GO)分析及RT-PCR验证。结果与0周小鼠相比,随着MCD饲料喂饲时间延长,小鼠体质量不断下降、肝缩小、转氨酶水平升高、血糖下降、血清甘油三酯和胆固醇略微下降、肝脏中甘油三酯显著增加,HE染色可见MCD喂饲第1周小鼠肝细胞出现水泡变性,MCD 2周组小鼠肝细胞发生气球样变,MCD 3周组小鼠肝脏存在广泛重度脂肪变性以及坏死肝细胞。基因芯片检测结果显示,MCD喂饲3周后导致小鼠肝脏出现8951个差异基因,其中3649个上调基因、5302个下调基因。富集分析结果显示,差异基因显著富集在炎症反应、氧化应激、凋亡、胆固醇合成、内质网应激(ERS)、鞘脂代谢、糖酵解、TGFβ通路、NF-κB通路和PPAR通路。采用RT-PCR对炎症、ERS以及TGFβ通路基因的变化进行验证,与芯片结果一致。结论利用MCD喂饲构建小鼠NASH模型成功,与正常小鼠相比,NASH小鼠肝组织大量基因表达水平存在显著差异,特别是炎症、应激等过程及其涉及的通路,可作为NASH疾病机制探索及药物研发的靶点。

肝细胞核因子1α通过调控葡萄糖转运蛋白2促进肾小管上皮细胞葡萄糖重吸收

目的:探究肝细胞核因子1α(HNF1α)通过葡萄糖转运蛋白(GLUT)调控肾脏葡萄糖重吸收的机制。方法:构建小鼠HNF1α表达载体,将重组质粒转染人胚肾HEK293T细胞和人肾小管上皮细胞HK2中过表达HNF1α,将HNF1α siRNA和GLUT2 siRNA转染入HEK293T细胞,采用流式细胞仪检测荧光葡萄糖类似物2-NBDG被细胞吸收的情况。采用Western印迹法检测HNF1α基因沉默后对GLUT2表达的影响。通过实时定量PCR检测HNF1α下游靶基因如GLUT2、钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)、胰岛素诱导基因1(INSIG1)等的mRNA水平,通过共聚焦免疫荧光检测GLUT2在肾上皮细胞的定位情况,使用荧光素酶报告基因和Western印迹法检测HNF1α对GLUT2的转录激活能力。通过凝胶迁移实验(EMSA)和染色质免疫共沉淀(ChIP)实验检测HNF1α与GLUT2的结合作用。结果:过表达HNF1α摄取2-NBDG的细胞比例明显高于对照组( P<0.01),HNF1α和GLUT2基因沉默后细胞对2-NBDG吸收作用减弱,HNF1α基因沉默后GLUT2表达减少。与对照组相比,过表达HNF1α使得肾脏包括GLUT2在内的有关糖转运基因表达水平上升( P<0.01)。过表达HNF1α显著增加GLUT2转录活性,干涉HNF1α可下调GLUT2转录活性。此外,HNF1α可与GLUT2的启动子直接结合。 结论:HNF1α通过直接结合GLUT2促进其表达,进而调节肾源细胞对葡萄糖重吸收作用。