膜转运体Megalin、Cubilin在C57小鼠肾发生发育中的时空表达研究

目的观察膜转运体Megalin、Cubilin在发生发育小鼠肾内的分布,从而揭示它们在肾发生发育中相应功能分化的时空规律。方法C57BL/6小鼠按雌雄1∶1合笼饲养,并于胚(胎)龄(Ed)E10、12、14、16、18 d,及生后日龄(Pd)P1、3、7、14、28、42 d,分离胎鼠、仔鼠或成鼠的肾脏。应用改良的块染技术对不同发育阶段的肾脏组织进行整体固定及染色,分别进行常规石蜡包埋,制成连续的石蜡切片(5μm)。选取连续切片中目标切片,采用免疫组织化学技术和免疫荧光技术对不同发育阶段的小鼠肾脏膜转运体Megalin和Cubilin进行定位,观察其在不同发育阶段的表达情况。结果Megalin和Cubilin在E10 d的中肾管上皮细胞开始有表达,E12 d时表达于肾脏输尿管芽上皮细胞的近腔面游离缘,二者主要以共表达模式存在。E14 d以后在发生发育小鼠肾脏的“逗号”小体、“S”型小体上皮细胞的游离缘呈弱表达,于肾脏近端小管的上皮细胞游离缘表达明显,偶尔可见在未发育成熟的血管球有弱表达。Megalin和Cubilin在细段、远端小管、集合管系统以及间质部分都未见表达。结论膜转运体Megalin和Cubilin在中肾管、输尿管芽、“逗号”小体、“S”型小体,以及近端小管的依次表达规律提示小鼠肾脏在中肾形成时期就开始有蛋白或多肽的转运功能。此外,二者稳定地出现在较为成熟的近端小管,较弱地出现在未成熟近端小管,表明其重吸收蛋白质的功能与近端小管结构的成熟度有关。

发生发育小鼠肾输尿管芽分支的形态特点

目的通过对输尿管芽树状结构三维追踪,结合形态学分析及测量,探讨输尿管芽分支模式及其末端诱导肾单位发生的数量。方法取胚胎期及生后多时间点小鼠肾脏各3只,制备石蜡和树脂连续切片,显微图像摄取并配准,计算机辅助输尿管芽追踪并可视化,计数其分支数及单个分支所诱导的肾单位数量。此外,石蜡切片进行HE染色用于生肾区与输尿管芽形态学观察,Claudin-7免疫组织化学染色标记输尿管芽,测量输尿管芽分支末端的数量及反映其密度的输尿管芽间距。结果输尿管芽树状分支三维可视化显示,起始的两主叉分支构成肾髓质,而皮质和生肾区分支茂密,输尿管芽分支末端间距越来越小。单个输尿管芽末端诱导肾单位数量由胚胎14.5 d的1个到胚胎17.5 d的2个,偶见3个。结论三维可视化显示输尿管芽树状分支呈区域复杂性,提示不同区域分子驱动不同的分支模式;而输尿管芽末端在生肾区的密度随肾脏发生发育而增加,与生肾区厚度减少相一致,而出生后分支末端的消失也反映了与肾单位祖细胞逐渐耗竭相一致。

小鼠致密斑后肾小管与入球微动脉毗邻关系的三维可视化

目的采用微细结构三维可视化技术,建立致密斑后远端小管与入球微动脉的空间走行,定位检测毗邻关系部位的蛋白。方法C57 BL/6小鼠灌流固定取肾,垂直于肾长轴切取组织块,树脂812包埋,从肾被膜到外髓外带,获得720张2.5μm厚的连续切片,通过计算机配准程序将数字化显微图像进行对齐,并采用C语言编辑的追踪程序对小管及血管走行进行三维重建。选取接触部位的组织切片,应用改良的免疫过氧化物酶染色方法检测H+-ATPase和Pendrin。结果通过重建3只小鼠90个肾单位的入球微动脉、远端小管及其延续的连接小管的走行,分析毗邻关系并测量长度,发现小管-入球微动脉密切接触多发生在浅表及中间皮质肾单位,其接触处的小管细胞表达H+-ATPase和Pendrin,是非A-非B型闰细胞。结论致密斑后的小管节段与入球微动脉的接触并非偶然,而是发生于远曲小管末端或(和)连接小管的非A-非B型闰细胞处,提示该部位的接触对致密斑处的管球反馈可能起拮抗作用,从而恢复肾小球滤过率和肾血流量。

受体Megalin和Cubilin在培养的Opossum肾近端小管细胞的表达

目的及方法 采用Western印迹法及免疫细胞化学双标记法检测肾近端小管培养的OK细胞株上受体megalin及cubilin的表达及分布。结果 受体megalin及cubilin在分离的OK细胞膜上有所表达 ,并且 ,应用me galin及cubilin抗体的免疫细胞化学双标记法显示 ,它们分布在细胞内顶部胞质的细胞内吞系统 ,包括微绒毛根部的有被小凹、胞内的有被吞饮小泡、大泡、溶酶体及参与细胞膜再循环的顶部致密小管。结论 这一分布特征提示 ,两种大分子糖蛋白受体与肾近端小管上皮细胞受体介导的细胞内吞功能有关。由于其分布极其接近 ,很可能在一些大分子的重吸收中起到相互作用。

受体Megalin和Cubilin在Opossum肾小管细胞的表达及定位

目的 检测肾小管细胞膜大分子糖蛋白受体Megalin和Cubilin在Opossum肾小管 (OK)细胞的表达及亚细胞分布。方法 采用Western印迹法、免疫荧光双标记法及免疫细胞化学双标记法。结果 受体Megalin及Cubilin在分离的OK细胞膜上有表达 ,荧光双标记显示两种受体十分相似地分布在细胞周边部 ,电镜下 ,标记金颗粒的两种受体相近地分布在细胞顶部胞质的细胞内吞系统。结论 两种受体在OK细胞上的分布特征与两种受体在体内肾近端小管小皮细胞的分布相似 ,提示OK细胞可成为研究两种受体介导可能的、未知的配体细胞内吞功能的有效细胞株 。

受体megalin和cubilin介导白蛋白吸收的免疫组织化学研究

目的及方法 采用免疫荧光双标记技术对培养的opossum肾 (OK)细胞膜受体megalin和cubilin的表达及其与荧光标记的白蛋白摄取的关系进行研究。结果 不同荧光标记的受体megalin及cubilin同时表达在相同的OK细胞上 ,分布主要局限在细胞膜 ,而且形式相似。被摄取的荧光标记的白蛋白点状分布在OK细胞内。此外 ,有受体megalin和cubilin表达的细胞就有白蛋白的摄取 ;反之 ,既不表达受体megalin和cubilin的细胞 ,也没有白蛋白的摄取。结论 这种白蛋白的摄取与受体megalin和cubilin表达的特征提示 ,两种大分子糖蛋白受体megalin和cubilin与白蛋白的摄取有密切相关性 ,很可能在肾小管重吸收白蛋白中起到相互作用。

人胎儿肋间肌纤维及神经支配组化特性的定性定量研究

采用琥珀酸脱氢酶（ＳＤＨ）、乙酰胆碱酯酶（ＡｃｈＥ）结合呈色和细胞图像分析等方法及手段，对孕龄３５－４０周的人胎儿肋间内外肌纤维进行分型，研究肋间内外肌纤维的构成比、不同型肌纤维的直径、运动终板面积和乙酰胆碱酯酶含量。对实验所得数据进行统计学处理。

小鼠肾发育中的细胞凋亡

目的：探讨小鼠肾发育过程中细胞凋亡的发生规律。方法：在树脂切片上，应用原位末端标记技术，观察昆明小鼠发育不同时期的肾中凋亡细胞的分布及量的变化。结果：在肾发生发育的过程中，肾皮质和髓质内几乎所有结构都有凋亡细胞散在分布。其中，肾小体的凋亡指数在生后14d达到高峰，而肾小管的凋亡指数从生后7d之后变化不大。同时，髓质中的间质细胞也发生了明显的凋亡变化。结论：伴随着肾各种结构的发生发育而出现的细胞凋亡是肾发育的一个基本特征，此过程延续到生后2周。肾单位的数量虽然在生后7d已经不再增加，但是肾小体结构的成熟和分化还在继续进行，可能将进一步促进肾小体滤过功能的成熟。

小鼠肾发育过程中增殖与凋亡相关蛋白在树脂切片上的表达

在石蜡切片或冷冻切片上做免疫组织化学实验经常遇到组织结构不全的问题。树脂包埋的组织可以展示保存良好的形态结构，但树脂包埋所采用的醛类固定剂可以和组织抗原交联，同时环氧树脂也掩盖了抗原的共价键，因此树脂切片上的抗原表达很弱[1]。

《组织学与胚胎学》实验教学模式改革探讨

组织学与胚胎学实验教学是组织学与胚胎学课程教学的重要组成部分,对提高学生对微细结构的认知和理论教学内容的理解起到了非常重要的作用。为了更好地发挥实验教学的作用,针对传统实验教学的不足,中国医科大学组织学与胚胎学教研室创建数码显微互动系统,将微课应用于实验教学中,并传承光镜、电镜相结合的实验教学模式和实施多样化实验考核形式对组织学与胚胎学实验教学进行一系列的改革,取得了良好的教学效果。

降低肾脏免疫组化染色背景着色的方法

传统的免疫组织化学染色从最初的PAP法发展到S-ABC法和SP法,特异性和灵敏度越来越高。最近几年发展的PV法又称为两步法使得免疫组化更加简单快速,背景更加清晰。但是有时还是因为染色背景过高而影响结果判定。本文介绍一种新的染色方法,在＂两步法＂基础上大大降低肾脏组化片的染色背景,从而提高结果判定的准确性。

小鼠肾近端小管的三维重建

目的研究小鼠肾近端小管三维空间走行的特点及规律。方法 C57/BL/6J小鼠3只,灌流固定后取肾组织块并树脂812包埋,垂直肾长轴连续半薄切片,从肾被膜到肾外髓外带共得到1 200张2.5μm厚的连续切片,显微镜下获取数字图像,计算机配准,C语言编程,追踪并三维重建58条近端小管走行。结果在皮质迷路中,近端小管起始段在离开肾小球后,均先向被膜方向走行约100～1 400μm后返折,在各自肾小球周围盘曲并占据相对独立的区域,很少和其他肾单位近端小管曲部区域重合。浅表皮质肾单位与中间皮质肾单位的近曲小管盘曲紧密,所占空间比近髓肾单位近曲小管小。在髓放线中,近端小管直部的走行有明显的层次:来源于浅表皮质肾单位的近端小管直部走行于中央,来源于皮质深部肾单位的近直小管则依次走行在其外围,皮质最深层的肾单位的近直小管几乎无直部。所有近端小管均止于肾外髓外带与内带的交界处,并移行为髓袢降支细段。结论小鼠近端小管的起始段、曲部和直部在皮质迷路与髓放线都有各自走行区间,其吡邻关系及所处生物学环境不同,这对肾近端小管不同节段对不同物质转运功能的生理及病理评估提供形态依据。

计算机辅助的小鼠肾连接小管三维重建

目的探讨肾连接小管(CNT)过渡为集合管系的空间走行规律。方法灌流固定3只C57/BL/6J小鼠,取肾组织块并树脂812包埋,从肾被膜到肾乳头共得到2000张2.5μm厚的连续切片,显微镜图像数字化并配准,计算机程序追踪38条CNT走行并测量其长度。结果来自长髓袢肾单位的CNT在胃皮质中上行,沿途与5～6条短髓袢肾单位CNT相互吻合成弓形管,弓形管或部分来自最浅表皮质的CNT在皮质浅层与集合管汇合。CNT各自走行约150～500μm,弓形管长度为600～900μm。结论肾单位只在皮质浅层经CNT或经弓形管汇入集合管系,集合管在穿过中层和深层皮质时不再有新的肾单位加入,提示肾小球滤过液在集合管下行过程中不再接受来自于其他肾单位的滤液,重吸收功能不受任何肾单位的影响。

发生发育小鼠肾近端小管的三维可视化

目的成年肾近端小管(PT)是急性肾小管病变最常累及同时也最易修复的节段,探讨基于三维可视化对发生发育期PT的形态发生进行时空性分析。方法取胚胎期(E)及生后(P)多时间点小鼠肾脏每组各3只,制备5μm石蜡切片,Claudin-2免疫组织化学染色标记PT,体视学测量PT在肾皮质中体积密度;制备2.5μm连续树脂切片并使之图像化,基于数字追踪和可视化软件展示PT的空间走行,同时测量其长度。结果P1小鼠PT在皮质中的体积密度明显大于胚胎期;随后经历了下降(P3、P5)、上升(P7)开始至稳定的成年水平(P28);E14.5、E17.5和P5小管三维可视化显示,发生发育PT的长度、曲部的盘曲数随小管成熟逐渐增加,但低于成年PT;E14.5、E17.5 PT的基本空间走行与成年相似,而PT起始段的走行及PT直部在髓放线走行的毗邻关系则较成年差异较大;P5部分PT的走行接近成年PT。结论PT的发育,无论是皮质中的体积密度、长度、空间走行,与肾的整体发育一致,始于S小体期,贯穿于胚胎期并延续至生后,止于肾发育成熟(P28)。

H-和L-铁蛋白在脑膜炎中抑制由于自由铁增高造成的脑损伤

目的检测铁蛋白与自由铁在脑膜炎大鼠大脑中的改变,探讨H-和L-型铁蛋白对该炎性病变脑损伤的保护作用。方法 40只新生Wistar大鼠作脑膜炎动物模型,雌雄各半,随机分组。大脑材料分别按形态学石蜡切片和定量分析的要求进行取材。利用Ferene-S方法测脑自由铁,免疫印迹测铁蛋白的表达,共聚焦显微镜观察RNA过氧化产物8-羟基鸟苷酸荧光信号。结果与对照组比较,脑自由铁在感染组中显著上升。H-和L-铁蛋白水平同时增加,且在大脑皮质与脑铁有共存关系。RNA过氧化指标8-羟基鸟苷酸无显著增加。结论大鼠脑膜炎病变过程伴随着脑自由铁的增加,但并未发生脑的过氧化损伤。H-和L-铁蛋白的表达能够结合自由铁从而保护大脑。

小鼠肾发育中肾乳头区的细胞凋亡

目的探讨小鼠肾发育中肾乳头区细胞凋亡的演变规律。方法应用原位末端标记技术并结合体视学分析方法检测小鼠肾发育中肾乳头区细胞凋亡的演变规律。结果 E16和E18 d时,肾髓质乳头区可见少量凋亡细胞;P1 d时,此区的凋亡细胞增多;P3 d和P5 d时,肾乳头下半部的凋亡细胞多于上半部;P7 d时,肾乳头上半部的凋亡细胞增多,多于下半部的凋亡细胞;P14和P21 d时,乳头区的凋亡细胞少见。结论发育早期肾乳头区主要通过细胞凋亡来完成形态的转变,随后管状结构增生,细胞凋亡减少,从而完成肾乳头结构的演变。

微课在医学本科生组织学与胚胎学教学中的应用

组织学与胚胎学课程是医学基础课程中的基础,对于医学本科生教育具有重要意义。近年来,其教学模式越来越多样化,包括微课、慕课、翻转课堂和虚拟平台等。其中,微课由于具有时程小而质精的显著优点,受到授课教师和学生的欢迎。针对组织学与胚胎学理论及实验教学内容多、课时压缩、图片及视频所占容量大的弊端,利用微课由点及面的特点,中国医科大学组织学与胚胎学教研室,在精选理论知识点和实验内容基础上,分别制作了理论课和实验课两套相关微课视频,建立了完整的微课教学平台,作为组织学与胚胎学授课和学习的辅助资源,在引导学生自主学习中发挥了重要的作用,取得了非常好的效果。

自制924液对热缺血肾脏的保护作用——兔、狗、人肾脏的研究

本文应用自制的９２４液注入肾脏后提高了肾脏对热缺血的耐受能力，动物实验的结果表明经９２４液常温下灌注后的肾脏能耐受热缺血２小时，其超微结构仍处于正常。恢复血流后２４小时肾功能恢复正常水平。

小鼠肾脏发生发育中BAX的表达

目的探讨小鼠肾脏发育过程中促凋亡蛋白BAX的表达。方法选取胚龄16、18d和出生后1、3、5、7、14、21d的小鼠共54只,应用免疫组织化学、免疫荧光技术并结合体视学分析方法观察树脂切片上小鼠不同发育时期BAX的表达。结果 BAX的表达主要出现在近端小管,随着发育的不断进行,BAX的表达由皮质的近髓质区逐渐发展到中层皮质区,最后出现在浅层皮质区。BAX的面数密度从E16d到P3d逐渐升高,随后下降,在P7d又逐渐升高。结论小鼠肾脏发育过程中BAX的表达与近端小管的发育密切相关,可能影响近端小管的存活、分化和成熟。