谷类作物半粒种子的PCR分析及其在标记辅助选择育种中的应用

建立了适于种子DNA分析的快速简便的PCR方法。水稻、小麦和玉米的半粒种子用提取缓冲液处理,产生的提取液可用于PCR和RAPD分析。水稻丰粒种子的DNA和来自叶片的DNA用专一的PCR引物扩增后可以产生同样的PCR产物。含有胚的另半粒种子可以正常发芽。将半粒种子的PCR分析方法用于水稻白叶枯病抗性基因型的鉴定,证明是植物育种和遗传学研究中一种非常实用的方法。

雄牛特异的SRY同源序列的扩增和分析

利用人、兔、鼠SRY序列设计引物,应用PCR扩增牛的SRY序列,获得200bp的雄牛特异的扩增片段。克隆该扩增片段,获得重组质粒pCH21,进行序列分析,并与人、兔和鼠SRY的对应区域比较,具有高度同源性。用pCH21 DNA作探针与牛的基因组DNA酶切图谱杂交,显示了雄牛特异的1.7kb的杂交带。分析200bp的PCR扩增片段是牛的SRY基因片段。用同一对引物扩增人和山羊的DNA样品,也获得雄性特异的200bp的扩增片段。

水稻白叶枯病抗性基因的研究与分子育种

由革兰氏阴性菌黄单孢水稻变种（Ｘａｎｔｈｏｍ ｏｎａｓｏｒｙｚａｅ ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ，Ｘｏｏ）引起的白叶枯病是世界水稻生产中最严重的细菌性病害。白叶枯病是一种维管束病害，自然条件下，病菌通常由水孔或伤口侵入，沿叶脉产生灰白色病斑。田间常在分蘖期观察到病症，并随植株的生长而发展，至抽穗期达到高峰。水稻遭受白叶枯病后，一般减产２０％ —３０％ ，严重时甚至绝收。白叶枯病最早于１８８４ 年在日本福岗地区发现。５０年代以来，发病范围扩大，目前白叶枯病的发生范围已遍及世界各水稻产区［１，２，３］。由于其危害严重，而化学防治难以奏效，种植抗病品种是经济有效的防治方法，这引起育种家们对抗病性和遗传规律研究的重视。多年来的研究在理论上和应用上取得了许多进展，主要表现在下面几个方面：从基因对基因的学说解释寄主和病原菌的相互作用，建立了标准的单基因寄主和相对应的病原菌生理小种的鉴别系统；随着水稻基因组研究的开展，通过分子遗传图谱和物理图谱的构建，对抗性基因进行了定位和克隆；利用分子标记辅助选择和基因工程手段，开始了水稻白叶枯病抗性的分子育种工作。

植物抗病基因的克隆与分子育种

植物抗病基因的克隆与分子育种翟文学，朱立煌（中国科学院遗传所植物生物技术实验室）植物抗病常常是由于宿主和病原菌的基本遗传因素的不相容引起。这些遗传因素决定了感染早期落特对病原菌的识别，然后导致植物中一系列生化反应、这些反应组成了名为过敏反应（Ｈｐｅｒ...

抗阿特拉津基因PCR检测方法的建立与应用

阿特拉津是一种均三氮苯类除草剂,其作用机理是取代质体醌与叶绿体类囊体膜上的32kDa蛋白的结合,从而阻断光系统Ⅱ的电子传递而使光合作用受阻。32kDa蛋白由叶绿体psbA基因编码,psbA基因的突变使32kDa蛋白的第264位丝氨酸变为苷氨酸或丙氨酸,从而丧失与阿特拉津结合的能力,导致对阿特拉津除草剂的抗性。由于阿特拉津除草剂在大豆产区的广泛使用。

BT型细胞质雄性不育恢复基因的基因定位

以典败率、圆败率、染败率、花粉育性和小穗育性为育性指标 ,对 BT型细胞质雄性不育系 731A、恢复系 C90 83以及 731A/C90 83的 F1 、731A//731B/C90 83的三交 F1 等亲本和杂种群体的育性进行调查分析 ,并以 731A//731B/C90 83的三交 F1 群体为材料进行 RFL P和微卫星标记分析 ,进行基因定位。结果表明 ,C90 83具有 1个主效的显性恢复基因。选用第10染色体上的 7个 RFL P和微卫星标记分析两个亲本 ,有 3个 RFL P标记在两个亲本间有多态 ;选用其中的 C16和 G2 91分析 731A//731B/C90 83的三交 F1 中的各个单株的结果表明 ,这两个 RFLP标记与 C90 83的恢复基因连锁 ,C16与这个恢复基因之间的交换值为 19.3% ,G2 91与这个恢复基因之间的交换值是 14.0 % ,C90 83的恢复基因与已报道的 BT型细胞质雄性不育恢复基因

高覆盖率水稻BAC库的构建及抗病基因相关克隆的筛选

利用含Xa4、xa5和xa13 3个水稻白叶枯病抗性基因的累加系IRBB56构建了一个水稻细菌人工染色体文库。该文库包含55 296个克隆，平均插入片段为132kb。按水稻基因组为450Mb计，该文库覆盖14倍基因组，筛选出任一水稻基因或序列的概率为99.99%。用均匀分布的3个叶绿体基因和4个线粒体基因克隆作探针筛选文库，结果显示该文库中含细胞器基因组DNA同源序列的克隆数小于1%。用分布于水稻3条不同染色体、分别与Xa4、xa5和xa13连锁的DNA标记筛选文库，分别检测出11～106个阳性克隆，为克隆这些基因打下了基础。 该文库对水稻基因组的高度覆盖率和较大的插入片段，非常适合于物理作图和基因的分离和克隆。

亚麻抗锈病基因M4的特异分子标记

用 5 2 0个 10碱基随机引物对含有亚麻抗锈病基因M4的近等基因系材料NM4及其轮回亲本Bison进行RAPD分析 ,其中OPA18引物在NM4材料中稳定地扩增出特异的DNA片段。用Bison与NM4杂交产生的F2 分离群体进行的遗传连锁性分析表明 ,RAPD标记OPA1843 2 与M4基因紧密连锁 ,二者之间的遗传距离为 2 .1cM。将OPA1843 2 片段回收、克隆和测序 ,成功地将其转化为SCAR标记。对不同抗源材料的扩增分析表明 ,该标记是M4基因的特异标记。目前这一标记已成功地应用于亚麻抗锈病基因M4的分子标记辅助选择育种。

经基因工程改良的抗白叶枯病水稻粳型恢复系“C418-Xa21”及其杂交稻

通过农杆菌介导的转化系统 ,将业已克隆的水稻抗白叶枯病基因Xa2 1导入重要的粳型杂交稻恢复系“C418”。PCR和抗性分析表明单拷贝整合的Xa2 1在T1 代的分离比为 3∶1。在T2 代通过PCR和抗性分析选择了Xa2 1纯合的转基因株系“C418 Xa2 1”。将选择的转基因纯合系“C418 Xa2 1”与常用的雄性不育系“屉锦A”杂交 ,产生了带有转基因Xa2 1的杂交稻“屉优 418 Xa2 1”(简称转基因杂交稻 )。分子分析表明转基因Xa2 1在杂交稻“屉优418 Xa2 1”中能稳定遗传 ;抗性分析表明转基因恢复系“C418 Xa2 1”和转基因杂交稻“屉优 418 Xa2 1”对白叶枯病具有高度的广谱抗性 ,并保持了受体对照的优良农艺性状。另外我们还发现转基因杂交稻“屉优 418 Xa2 1”对白叶枯病的抗性水平高于转基因恢复系“C418 Xa2 1” ,这可能是遗传背景的差异所致。抗白叶枯病转基因粳型恢复系和杂交稻的育成将有益于杂交稻在我国北方稻区的推广。

水稻抗白叶枯病基因Xa-25的分子定位

Xa 2 5是从体细胞突变体HX 3中鉴定出的水稻抗白叶枯病基因。通过花药培养构建了 0 2 4 2 8(粳稻 )和HX 3(籼稻 )的双单倍体 (DH)群体 ,该群体包含了 12 9个稳定株系 ,以我国长江流域水稻白叶枯病的代表菌株浙173对DH群体进行抗病性鉴定 ,抗病株系数和感病株系数分别为 6 2和 6 7。共选用覆盖水稻 12条染色体的 30 0对SSR引物对 0 2 4 2 8和HX 3进行多态性分析 ,有 74对引物在双亲之间表现差异。利用这些差异引物对DH群体进行连锁分析 ,从而将抗白叶枯病基因Xa 2 5定位到第 4染色体长臂末端的两个SSR标记RM6 74 8和RM 115 3之间 ,连锁距离分别为 9 3cM和 3 0cM。

转基因水稻T-DNA侧翼序列的扩增与分析

利用现有的转抗白叶枯病基因Ｘａ２１的水稻材料，通过ＴＡＩＬ－ＰＣＲ技术扩增出携带Ｘａ２１基因的Ｔ－ＤＮＡ的侧翼序列。对２４个有效扩增片段的序列分析结果表明，其中１４个侧翼序列是水稻ＤＮＡ，９个含载体主干序列，１个是外源基因Ｘａ２１片段。１４个Ｔ－ＤＮＡ侧翼的水稻ＤＮＡ序列与直接转化法外源基因整合位点的基因组序列具有不同的特点。这些Ｔ－ＤＮＡ在水稻染色体上整合后其两端序列的特点类似于在转基因双子叶植物中观察到的现象。在含主干序列的侧翼序列（３７．５％，９ ／ ２４）中，载体主干序列是以不同的类型出现的。

“神舟四号”航天搭载水稻变异性状的田间调查

通过对“神舟四号”卫星搭载水稻种子及其后代的研究,结果表明:6个搭载品种种子的发芽率、存苗率、结实率及植株的性状在当代(SP1)与对照相比均没有明显的变化;但在SP2代株高、生育期、分蘖、叶色、芒和红叶耳等性状上发生明显的变异,选择出一些突变株。突变株经SP3代,SP4代验证,最后获得32株高突变体,27株早熟突变株,20株多分蘖突变株,还获得一些农艺性状稳定性状且表现良好的株系,以及独杆、无芒、叶色黄化和类病变等有功能基因研究价值的突变体。

利用RAPD标记构建美洲黑杨×欧美杨分子标记连锁图谱

本文利用RAPD标记和美洲黑杨(Populusdeltoides)×欧美杨(P.euramericana)的F1 群体 ,构建了美洲黑杨×欧美杨的分子标记连锁图谱。实验过程中对1040个寡核苷酸随机引物进行了重复筛选 ,共选出127个引物用于作图群体(包括双亲共92个无性系)的随机扩增 ,这127个引物产生229个多态基因座 ,其中符合“拟测交”1∶1分离的有214个。利用多点连锁分析 ,形成19个连锁群及6个三连体和14个连锁对。由19个连锁群构成的图谱含标记129个 ,总图距为1914 2cM ,覆盖杨树基因组约73 62 %。标记间的平均间距为14 84cM。本研究获得了中等密度的美洲黑杨×欧美杨的一个连锁框架。

水稻抗白叶枯病基因Xa-4的PCR标记研究

根据与水稻抗白叶枯病基因Ｘａ－４紧密连锁的分子标记Ｍ５５的序列设计引物，通过对国际水稻研究所育成的抗白叶枯病近等基因系和基因累加系的叶片ＤＮＡ、半粒种子提取物及Ｘａ－４基因的杂合体ＤＮＡ的ＰＣＲ特异扩增，初步建立了Ｘａ－４的ＰＣＲ标记体系。进而用该标记体系对我国籼型杂交水稻常用的亲本材料进行分析，揭示出了Ｘａ－４在这些材料中的分布情况。

无选择标记和载体骨干序列的Xa21转基因水稻的获得

利用双右边界T-DNA载体通过根癌农杆菌介导法将水稻白叶枯病广谱抗性基因Xa21导入杂交稻重要恢复系C418中。T0代共获得27个独立转基因株系,通过田间抗性鉴定与PCR分析,有17个株系的Xa21基因分子鉴定为阳性,且对白叶枯病原菌P6生理小种具有抗性。通过对17个株系的后代植株进行田间抗性鉴定,分子标记辅助选择及Southern杂交分析,结果显示4个株系的T1代植株中能分离出无潮霉素标记基因的Xa21转基因植株。无选择标记Xa21转基因株系的获得率为15%。PCR检测还表明,这些无选择标记的Xa21转基因植株不带有载体骨架序列。通过对转基因后代进一步的抗性鉴定与PCR辅助选择,获得了无选择标记和载体骨架序列的转基因Xa21纯合的抗白叶枯病水稻。

水稻中一个NBS-LRR抗病同源基因家族的克隆和分析

利用克隆的抗病基因同源序列RS13作为探针,从水稻IR64的BAC文库中筛选到4个阳性克隆,其中一个克隆14E19能够覆盖其余3个克隆。对14E19进行全序列测定和分析,获得了73kb的全长DNA序列,基因预测显示其上有4个编码NBSLRR结构域的基因(NL),分别命名为NLA,B,C和D。对具有相同基因组背景的IRBB56同一染色体位置上跨度更大的BAC克隆106P13进行分析,发现其上有10个NL同源拷贝,其中4个同14E19上的NL一样。搜索日本晴、9311、广陆矮4号的序列,发现三者有类似的同源序列。但与已知的NBSLRR抗病基因同源性较低,说明NL是一个至少由10个成员(分别命名为NLA至J)组成的新基因家族。对NL家族进行RTPCR和cDNA库筛选分析,发现NLB基因能够在抗白叶枯病品系IRBB4中表达,暗示该基因参与了抗病反应。

Xa21转基因杂交稻组合汕优63和汕优559对白叶枯病的抗性

采用包括与 Xa2 1相匹配的鉴别菌系在内的 12个国际鉴别小种和中国 7个病原型 ,接种由明恢 6 3、盐恢 5 5 9的Xa2 1转基因单拷贝抗性纯合系与珍汕 97A杂交获得的转基因杂交稻汕优 6 3(汕优 6 3- Xa2 1) 73个 F1 群体和转基因杂交稻汕优 5 5 9(汕优 5 5 9- Xa2 1) 13个 F1 群体 ,测定转基因杂交稻对白叶枯病的抗性。结果表明这 2个转基因杂交稻组合具有优良的广谱抗性 ,抗谱与 Xa2 1基因供体 IRBB2 1相同 ,非转基因杂交稻表现感病。

利用RAPD标记和单株树大配子体构建马尾松的分子标记连锁图谱

利用300个随机的寡核苷酸引物和马尾松(Pinus massoniana Lamb.)种子的胚乳(大配子体)产生的随机扩增多态性DNA(RAPD)分子标记,进行马尾松标记连锁图谱的构建。经筛选共获得64个稳定的RAPD标记,利用多点连锁分析,其中的48个标记分属于13个不同的连锁群(连锁对),该图谱覆盖的基因组总长度约为692.5cM(centimorgan),标记间平均距离约为14.7cM,它为马尾松连锁图谱的构建提供了一个连锁框架。

利用功能标记鉴定普通野生稻中的白叶枯病抗性基因

以9个菲律宾白叶枯病菌小种对供试的9份普通野生稻(Oryza rufipogonGriff.)及1份高感白叶枯病材料IR24进行抗性鉴定,发现IR24对所有的菌株都表现为高感,6份野生稻材料对9个菌株表现全抗,占参试野生稻总数的67%。取自广西玉林的1份材料只感PXO280(P8),海南万宁的1份材料感PXO71(P4),广州高州的1份材料对PXO79、PXO99和PXO339感病,而这几份材料对其余菌株都表现为抗病,说明每份材料至少含有1个抗性基因。利用已克隆的白叶枯病抗性基因xa5、xa13、Xa21和Xa27的功能标记检测,结果表明9份供试普通野生稻中都不含抗性基因xa5、Xa21;5份为显性Xa13纯合体,4份为隐性抗病xa13杂合体;5份为抗病显性Xa27纯合体,3份为隐性xa27纯合体,1份材料中xa27和Xa27都不存在。

分子标记辅助选择Xa23基因改良杂交稻亲本的白叶枯病抗性

白叶枯病是世界上影响水稻产量最严重的病害之一,本研究利用携有目前已知的、抗谱最广和抗性最强的显性基因Xa23的水稻材料CBB23作为基因供体,以感白叶枯病的杂交水稻的3个骨干亲本培矮64S、明恢86和C418作为受体,采用杂交和复交,在分离群体中利用与Xa23紧密连锁的SSR标记RM206进行分子标记辅助选择。通过分子标记检测、田间抗性鉴定和农艺性状选择,BC3F3株系中获得Xa23基因纯合且农艺性状稳定的培矮64S、明恢86和C418。获得的恢复系或不育系及配制的杂交组合在田间对我国7个以及菲律宾P1和P6白叶枯病生理小种都具有抗性。