野生型非洲猪瘟病毒多重数字PCR方法的建立

为建立一种鉴别诊断野生株和基因缺失株非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的方法,针对ASFV的B646L、EP402R、DP96R基因保守序列设计3套引物和探针,优化三重荧光定量PCR体系作为基础建立微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)检测方法,并对方法的特异性、灵敏性及重复性进行评估。结果显示,优化后的多重荧光定量PCR检测方法的标准曲线线性关系良好,对PRRSV、PEDV、PRV、VSV、PCV、RNase-free水、重组质粒标准品进行特异性检测,特异性良好;重复性试验结果显示,变异系数均小于2%;对3种重组质粒的最低检测下限均为102 copies/μL。参照上述多重荧光定量PCR方法优化后的条件,进行多重ddPCR检测方法的建立,并且对该方法进行评价。结果显示,ddPCR检测方法标准曲线的线性关系良好;特异性及重复性良好;最低检测下限B646L为11.6 copies/μL、EP402R为13.3 copies/μL、DP96R为16.9 copies/μL;ddPCR的检测灵敏度比荧光定量PCR有优势。使用建立的多重ddPCR方法对14份P3实验室中的样品进行实验室样品检测,样品检测符合率达到100%。成功建立了能够同时检测用于鉴别野毒株感染与疫苗株的荧光定量PCR和微滴式ddPCR方法。

非洲猪瘟病毒K205R蛋白重组腺病毒载体的构建及小鼠免疫效力评价

为了研制安全有效的非洲猪瘟(ASF)疫苗,本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV) Georgia 2007/1株基因组序列合成ASFV K205R基因,通过同源重组技术构建重组腺病毒Ad5-ASFV-K205R,使用Western blot检测K205R非结构蛋白的表达情况,PCR检测其遗传稳定性,腺病毒滴度检测试剂盒测定其滴度。使用重组腺病毒免疫BALB/c小鼠,通过ELISA测定血清K205R特异性抗体,采用多因子检测试剂盒测定血清中IFN-γ和IL-4细胞因子含量,采用CCK8法检测淋巴细胞的增殖情况。结果显示,成功包装出重组腺病毒Ad5-ASFV-K205R,能够正确表达K205R融合蛋白;接种293T细胞并连续传代20代,均可稳定遗传,病毒滴度可达9.5×1010PFU/mL;ELISA结果显示,小鼠一免后7~21 d可检测到K205R特异性抗体,并在二免后14 d内产生更高的抗体水平;K205R蛋白能显著刺激免疫小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4,同时也能显著刺激脾脏淋巴细胞增殖(P<0.05)。结果表明,Ad5-ASFV-K205R重组腺病毒免疫小鼠能诱导机体的体液免疫应答和细胞免疫应答,具有很好的应用潜能,为进一步研发ASF疫苗提供基础。

CpG和ICTYOLANE^(TM)31佐剂对ASFV-CD2v蛋白免疫效果的影响

探讨CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides,CpG ODN)和ICTYOLANE^(TM)31微乳佐剂对重组表达的ASFV-CD2v蛋白在小鼠体内免疫效果的影响。以杆状病毒表达的CD2v蛋白为抗原,分别配伍CpG寡脱氧核苷酸(CpG oligonucleotide,CPG ODN)和ICTYOLANE^(TM)31微乳佐剂,皮下免疫BALB/c小鼠。首次免疫后14 d进行二免,采集首免后0、14 d以及二免后7、14及28 d血清,通过间接ELISA检测血清中CD2v抗体水平;采集二免后35 d小鼠分离脾脏淋巴细胞,通过流式细胞术分析IFN-γ水平。结果显示,间接ELISA结果显示在二免后7 d可检测到较高水平的CD2v抗体,ICTYOLANE^(TM)31佐剂和CPG ODN佐剂组抗体水平明显高于蛋白组。T细胞亚群分析结果显示,在二免后35 d,CpG ODN佐剂组的CD4^(+)T淋巴细胞的比例最高,达到81.34%,ICTYOLANE^(TM)31佐剂组CD8^(+)T淋巴细胞的比例最低,仅为11.37%。ICTYOLANE^(TM)31佐剂组CD4^(+)/CD8^(+)比值最高,ICTYOLANE^(TM)31佐剂组CD4^(+)T细胞IFN-γ分泌水平最高,可达9.07%,但CpG ODN佐剂组、ICTYOLANE^(TM)31佐剂组及蛋白组间差异不显著。推断,小鼠在第二次免疫后7 d产生了较高水平的抗体,CpG ODN、ICTYOLANE^(TM)31佐剂对ASFV-CD2v蛋白均可增强免疫小鼠产生CD2v抗体的水平,其中CpG ODN佐剂作用更强。ICTYOLANE^(TM)31佐剂及CpG ODN佐剂可以增强机体细胞免疫,其中ICTYOLANE^(TM)31佐剂作用更强。该研究为非洲猪瘟亚单位疫苗相关佐剂的筛选提供了一定参考。