人抗P53蛋白单克隆抗体的制备及评价

目的制备获得人P53蛋白单克隆抗体,并应用于免疫组化检测。方法利用基因重组方法,将p53基因构建到原核质粒载体上并诱导表达,将收集获得的P53蛋白免疫小鼠,经细胞融合及亚克隆手段获得鼠源单克隆抗体,与商品化的抗体DO-1共同染色蜡块包埋的病理组织样本,比较二者的染色结果。结果在筛选获得的与DO-1检测结果相近的5株抗体内,取检测结果最接近的1株抗体5E10,经Protein A/G株纯化抗体,与收集获得的数例癌症组织蜡块进行免疫组化验证,发现结果均与DO-1的结果无明显差异。结论成功制备并筛选出1株人抗P53单克隆抗体,可用于免疫组化染色。

CYFRA21-1双抗体夹心酶联免疫检测方法的研制

目的：建立人血清CYFRA21-1双抗体夹心酶联免疫检测方法。方法：以高碘酸钠法标记4株自制的CY-FRA21-1单克隆抗体，从中筛选配对抗体，建立双抗体夹心ELISA检测方法，并对其特异性、稳定性和灵敏度进行评价。结果：在4株单克隆抗体中筛选出1对配对抗体：2 F9株做包被抗体、6 F11株做酶标抗体。以0．50μg/ml的包被浓度、1∶6000的酶标抗体稀释度建立双抗体夹心检测方法。标准曲线在0．7～25 ng/ml范围内成线性关系，相关性为99．08％，最低检测限为0．6668 ng/ml，回收率为98．14％；与血清类似物的交叉性反应低于0．1％；批内（n＝10）、批间（n＝5）精密度分别为6．8％和11．4％，与国外试剂盒检测对比的相关性为91．42％。结论：成功地建立了双抗体夹心ELISA检测人血清CYFRA21-1的方法，为后续的检测试剂盒的生产奠定基础。

糖类抗原19-9单抗制备及DAS-ELISA的建立

目的：为制备糖类抗原19-9（Carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）特异性单克隆抗体。方法：以免疫后小鼠血清效价及其IC50值确定融合用小鼠，融合、筛选获得阳性杂交瘤细胞株。制备、收集并纯化腹水抗体，紫外分光光度法测定抗体浓度；辣根过氧化物酶标记抗体后，筛选配对抗体建立DAS-ELISA检测方法，并与国外检测试剂盒进行对比验证检测性能。结果：细胞融合后获得3株单抗细胞株（ZJY1-2C8、ZJY2-7F10、ZJY3-1G9），筛选确定ZJY3-1G9作为包被抗体、ZJY2-7F10作为酶标抗体，成功建立DAS-ELISA检测方法，最低检测限为26.4 U/ml。线性范围为30～300 U/ml。通过检测病患血清33份，证实与国外试剂盒检测的相关系数r＝0.9504。结论：所制备的单抗可用于CA19-9试剂盒的研制。

角蛋白19片段单克隆抗体的制备及鉴定

为制备角蛋白19片段(CYFRA21-1)的单克隆抗体(mAb),采用间接ELISA方法检测免疫小鼠的抗体效价,融合、筛选、克隆化单克隆抗体,将筛选得到的单克隆细胞株注入小鼠腹腔制备腹水,采用辛酸硫酸铵法、蛋白A柱纯化腹水抗体,以SDS-PAGE凝胶电泳、紫外分光光度法检测抗体纯度和浓度;利用鼠抗体亚型鉴定试剂盒对单克隆抗体进行亚型鉴定;采用阻断ELISA法测定mAb的敏感性(IC50)。结果表明,筛选获得4株分泌角蛋白19片段mAb的细胞株,将4株细胞株2F9、3H5、7C3、6F11注入小鼠腹腔,分别获得效价为2.56×105、5.12×105、5.12×105、2.56×105的单克隆抗体,经纯化,抗体蛋白浓度为12.43mg/mL^16.00mg/mL,为IgG1型抗体,其IC50在1.03ng/mL^1.53ng/mL之间。说明获得了4株分泌高效价CYFRA21-1单克隆抗体的细胞株,为建立CYFRA21-1的检测试剂盒奠定了基础。

程序性细胞死亡配体1胞外区原核重组表达、纯化及其多克隆抗体制备

为制备程序性细胞死亡配体1胞外区多肽及其鼠源性多克隆抗体,根据UniProtKB数据库中公布的其胞外区基因序列(标识符:Q9NZQ7-1)和原核表达载体pET-28a(+)Nde I上游和Xho I位点下游的序列,设计合成带有同源臂的特异性引物.以合成的PD-L1胞外区基因为模板,PCR扩增程序性细胞死亡配体1胞外区基因并将其克隆至pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)-PD-L1-E,转化至大肠杆菌DH5α中,扩增并提取其质粒,然后将质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达.亲和层析镍柱纯化重组蛋白后,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定,确认表达蛋白正确.浓缩换液后用重组蛋白免疫Balb/c品系小鼠制备多克隆抗体,经ELISA检测,成功获得抗程序性细胞死亡配体1胞外区血清.该研究对于研发某些肿瘤伴随诊断检测试剂有重要意义.

甲状腺转录因子-1单克隆抗体的制备及其应用价值分析

目的制备甲状腺转录因子-1(TTF-1)单克隆抗体,为临床工作及后续研究奠定基础。方法以聚合酶链反应扩增目的基因,并构建TTF-1/pET32a重组质粒,诱导表达融合蛋白,经镍琼脂糖亲和层析柱洗脱目的蛋白,并将洗脱液经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白纯度,经过免疫学评价合格后,进行小鼠体内免疫,效价评价后通过细胞融合筛选阳性细胞株,制备分泌TTF-1单克隆抗体,并对得到的抗体进行免疫组化验证。结果获得能稳定分泌TTF-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,且其产生的抗体与TTF-1抗原具有良好的免疫学反应。结论成功制备出TTF-1单克隆抗体,为进一步提高相关肿瘤的诊断率提供了新的试剂。

适用免疫组化的突触素与嗜铬素A单克隆抗体的制备与临床初步评价

目的:制备突触素与嗜铬素A免疫组化单克隆抗体,期望可初步应用于临床。方法:设计Syn与Cg A融合基因,并构建至表达载体上表达获得融合蛋白。经过抗原免疫、细胞融合后筛选获得目标抗体。通过临床样本对比验证,研究Syn和Cg A两者的特异性,评价相关系数。结果:通过筛选,共获得2株分别针对Syn与Cg A的抗体3D9和4A12。通过对比抗体试剂共同验证19种蜡块组织,统计结果分析,结果符合性较好,相关系数分别达到r=0.989 2与r=0.993 9。结论:该方法成功制备获得了可初步适用于免疫组化的突触素与嗜铬素A抗体,该方法可为免疫学抗体研究提供一定的借鉴意义。

孕激素受体A型原核表达及单克隆抗体制备

目的:制备孕激素受体A型单克隆抗体,为后期应用到免疫组化实验提供支持。方法:选择无缝克隆的方法将目的基因与载体连接到一起,通过诱导表达收集蛋白,经过免疫后细胞融合获得单克隆抗体。将该单克隆抗体经免疫组化验证。结果:将融合后筛选的阳性细胞制备获得的单克隆抗体7C7经免疫组化验证,发现其在乳腺癌、子宫肌瘤组织中呈现阳性,在直肠癌组织、平滑肌组织中呈现阴性,符合目的抗体的要求。结论:该方法获得的孕激素受体A型单克隆抗体较常规方法周期短,获得的抗体在不同组织间结果符合预判,对后期研究区别PR-A、PR-B,临床推广具有重要意义。

雌激素受体α型抗体的制备及临床应用研究

目的:以原核表达的雌激素受体α(ERα)为抗原制备ERα抗体,分析该抗体应用于临床的可行性。方法:以原核表达的ERα蛋白免疫BALB/c小鼠,制备9株单克隆抗体的杂交瘤,对9株抗体进行分析鉴定;临床应用免疫组化技术,选出与Leica公司的ER抗体敏感性相近的抗体C6H7,并对其进行106份临床对比实验。结果:9株抗体均为Ig G类,与PR、Ki-67、P53、AFP抗原无交叉,其中克隆C6H7与Leica的ER抗体的对比实验显示一致性较好(κ≈0.979,χ2≈0.021)。结论:以原核表达的ERα制备的单克隆抗体C6H7可用于乳腺癌的免疫组化检测。

动物内源性多肽CGA-N46抗菌谱及对动物细胞的作用

目的研究抗真菌肽CGA-N46的抗菌谱及对不同动物细胞的作用效果。方法采用微量稀释法测定CGAN46对14种常见病原真菌的抗菌活性;采用分光光度法检测CGA-N46对红细胞的溶解作用,采用MTT法测定CGAN46对鸡胚成纤维细胞的毒性作用及对癌细胞的抑制作用。结果 CGA-N46对光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、白念珠菌具有抑菌活性,其MIC分别为4.0、4.0、0.5、1.0、1.0mg/ml;最小抑菌浓度的CGA-N46无溶血作用,对鸡胚成纤维细胞无毒性,但对肺癌A549细胞有抑制作用,72h最大抑制率为60.53%。结论 CGA-N46多肽具有抗念珠菌作用,且具有抗癌潜力,而对正常细胞安全、无毒性。

一株CD10单克隆抗体的制备

CD10在临床应用中常被作为急性白血病和非霍奇金淋巴瘤分类中的诊断指标之一,本研究旨在制备CD10鼠单克隆抗体并将其应用于临床诊断。用原核表达的CD10胞外区段蛋白免疫小鼠,经细胞融合后筛选出一株可分泌CD10抗体的细胞株,该抗体经多种临床组织验证,其免疫组化结果与目前市售的进口抗体染色结果相一致。该研究提示,所制备的CD10抗体可应用于临床病理诊断。

人17号染色体计数探针的制备及应用

[目的]利用PCR法(链式聚合酶反应)制备17号染色体的绿色荧光计数探针。[方法]首先通过对人类基因组17号染色体着丝粒序列分析,找出其特异性的重复序列,设计引物,通过PCR法制备绿色荧光探针,然后利用荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)实验检验所制备17号染色体计数探针质量。[结果]FISH实验结果显示,利用PCR法制备的计数探针荧光信号清晰可辨。[结论]PCR法可良好地应用于17号染色体计数探针(Chromosome 17 enumeration probe,Cep17)的制备,制备的探针可用于相关疾病的检测。

细胞角蛋白19单克隆抗体的制备及组织芯片法评价

目的利用组织芯片法对自制细胞角蛋白19(cytokeratin 19,CK19)单克隆抗体进行临床评价。方法通过CK19抗原免疫BALB/c小鼠,经细胞融合及筛选,免疫组化初筛获得CK19单克隆抗体细胞株。进一步制备腹水并纯化CK19抗体,对该抗体及商品化对照抗体进行组织芯片法评价。结果经过细胞融合共筛出1株较好的杂交瘤细胞株2H5,纯化后的抗体纯度达95%,SDS-PAGE分析可见相对分子质量约55 000和25 000的重链和轻链条带,该抗体与对照抗体经组织芯片法评价,两者相关系数r=0. 994 7。结论经组织芯片法评价,自制CK19单克隆抗体与对照抗体相比无明显差异,为后续开展大量临床组织研究提供了依据。

非小细胞肺癌ALK基因重排检测

目的通过荧光原位杂交（FISH）方法检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者间变性淋巴瘤激酶（ALK）基因重排。方法根据ALK断裂重排方式及特点，设计并制备红／绿双色荧光探针。以人外周血培养细胞为检测对象评价ALK融合基因检测探针的敏感性和特异性，以NSCLC石蜡组织样本为对象进行ALK基因重排检测以评价探针的性能。结果本研究制备的荧光探针在EB病毒（EBV）转化的人淋巴细胞检测中的特异性和敏感性均可达到100％。在对2例NSCLC患者石蜡包埋组织样本检测中，检测阴性、阳性各1例，检测结果与免疫组织化学检测结果一致。结论本研究中制备的双色荧光探针可用于NSCLCALK基因重排的检测。