胰高血糖素样肽-1的聚乙二醇定点修饰

采用分子量为5kDa的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC)修饰胰高血糖素样肽-1(GLP-1),建立了GLP-1的定点修饰反应及分离纯化工艺,考察了修饰反应各因素对单修饰产物得率及体外活性的影响,得到优化修饰条件为:pH7.5,50mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液,GLP-1浓度1mg/mL,PEG/GLP-1摩尔比2:1,4℃下反应1h.在此条件下,单修饰PEG-GLP-1得率达50%.反相高效液相色谱分离纯化所得单修饰产品纯度达98%,体外活性保留为未修饰GLP-1的86%,其在Sprague-Dawley远交群大鼠体内的循环半衰期为60min,比原肽提高了20倍.

干扰素α-2b的聚乙二醇修饰

采用分子量为20kD的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)修饰重组人干扰素α-2b(IFNα-2b),建立了修饰反应及分离纯化工艺。考察了修饰反应各因素对单修饰转化率以及单修饰产物体外活性的影响,获得了优化的修饰反应条件,即在pH6.5,20mmol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中,干扰素α-2b的浓度为4mg/mL,PEG与IFNα-2b的摩尔比为8:1,4oC时反应20h;在优化的反应条件下,单修饰PEG-IFNα-2b的转化率达到55%。并且,采用离子交换层析对修饰产物进行分离纯化,单修饰产品纯度达到97%,体外活性保留达到未修饰干扰素α-2b的13.4%,其在SD大鼠体内的循环半衰期得到了较大的延长,且具有较好的水溶液稳定性。

胰高血糖素样肽-1在乙醇中的聚乙二醇修饰

以乙醇为溶剂,单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC)为修饰剂,对胰高血糖素样肽-1(GLP-1)进行了修饰反应条件的优化,同时对单修饰产物Mono-PEG-GLP-1进行分离纯化,并考察了其体外稳定性和体内活性.得到的优化反应条件为:GLP-1浓度1mg/mL,mPEG-SC与GLP-1摩尔比1:1,37℃下反应24h,该产物最高转化率达77%.采用冷冻离心方式对Mono-PEG-GLP-1进行初步分离和浓缩,然后经反相液相色谱进一步高效纯化,纯度可达97%以上.体外实验表明,Mono-PEG-GLP-1在血清中具有更好的稳定性及更强的抗胰蛋白酶消化能力.体内动物实验表明,Mono-PEG-GLP-1具有更好的降血糖作用.

聚乙二醇修饰蛋白体系的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法新探

比较了聚乙二醇修饰蛋白体系的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)银染、考染、碘化钡染色3种染色方法;提出和比较了银染-碘化钡复染和考染-碘化钡复染2种复染方法。结果表明,银染-碘化钡复染的凝胶中,未修饰蛋白条带消失,PEG修饰蛋白条带保留,游离PEG条带显色;而考染-碘化钡复染的凝胶中,未修饰蛋白、修饰蛋白和游离的PEG条带可同时显色。两种复染方法中,PEG组分的检测限均达到了0.01μg。因此,对PEG修饰蛋白体系的SDS-PAGE可先用考染或银染后再用碘化钡复染,便可在同一块凝胶上先后或同时观察到未修饰蛋白、修饰蛋白和游离PEG的情况,简化了实验操作,方便了实验结果的比较分析。