编码Ag85A基因突变体的设计与合成

自行设计和合成可转录mRNA不能翻译功能性蛋白分子的全长Ag85A编码基因突变体(Ag85A-M),克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP,用于后续制备Ag85A-M疫苗,研究双股Ag85 DAN疫苗是否能通过RNA传感器提呈抗原信息,诱导固有和适应性免疫应答。设计Ag85A-M基因,将编码Ag85A基因(891 bp)中的第114位和230位的碱基C突变为G,使之含有TAG和TGA双重翻译终止子。合成Ag85A(M)全基因片段,利用普通PCR方法按照设计将Ag85A(M)全基因序列分别拆分成332 bp(A)、332 bp(B)、264 bp(C)三个小片段和488 bp(D)、423 bp(E)两个小片段进行扩增合成。构建pIRES2-EGFP-Ag85A(M)载体,将Ag85A(M)全长基因片段通过pIRES2-EGFP载体多克隆位点(multiple clone site, MCS)中双酶切位点EcoR I/BamH I插入载体,再经双酶切和基因测序鉴定,DC2.4中基因表达确认。结果显示,采用普通PCR法分段扩增合成获得与预先设计的长度一致的A、B、C、D和E小片段,合成的Ag85A-M的全部序列(891 bp)、突变位置和碱基正确。三片段拆分(A、B和C小片段)阳性克隆率平均值为87.67%,基因保真度为90.33%。二片段拆分(D和E小片段)阳性克隆率平均值为81.5%,基因保真度为23%。结果表明,本研究获得了可用于后续研究的含有114和230位点突变的全长Ag85A-M DNA片段,三片段基因拆分方法获得的332 bp及以下片段PCR法合成保真度显著高于二片段拆分方法获得的423 bp及以上片段。