C/EBP-α基因在大鼠肝星状细胞株HSC-T6自噬中的作用

目的探讨CCAT增强子结合蛋白α(C/EBP-α)在肝星状细胞(HSCs)自噬过程中是否发挥作用。方法构建携带C/EBP-α的慢病毒载体Lenti-C/EBP-α,感染大鼠肝星状细胞株HSC-T6,Western blot检测自噬相关蛋白LC3 (微管相关蛋白1轻链3)表达;采用自噬激活剂Rapamycin处理HSC-T6,Western blot检测C/EBP-α和LC3的表达;将HSC-T6经Lenti-C/EBP-α及自噬激活剂Rapamycin共处理,Western blot检测C/EBP-α和LC3的改变。结果 HSC-T6感染Lenti-C/EBP-α后,自噬活性降低,LC3表达下降;Rapamycin处理HSC-T6后,自噬活性增高,C/EBP-α表达下降,LC3表达增多;HSC-T6经Lenti-C/EBP-α及自噬激活剂Rapamycin共处理,与单纯使用Rapamycin比较,C/EBP-α表达升高,LC3激活减少,抑制HSCs激活。结论 C/EBP-α可以抑制自噬激活,从而抑制HSCs激活,为C/EBP-α抗肝纤维化提出了新思路。

活化的大鼠肝星状细胞赖氨酸乙酰化蛋白质组学分析

目的对活化的大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)进行赖氨酸乙酰化(lysine acetylation,Kac)蛋白质组学分析。方法于清洁级雄性SD大鼠中提取并培养原代HSCs,分为对照组(培养<2天)和活化组(培养≥10天)。对两组细胞进行裂解,iTRAQ/TMT标记后的成对肽段样品采用乙酰化抗体进行亲和富集,应用高分辨率LC-MS/MS技术进行质谱鉴定。最后对质谱鉴定的乙酰化蛋白质进行生物信息学分析。结果应用LC-MS/MS技术、GO注释和KEGG通路等生物信息学分析方法,共确定309种蛋白质中的470个Kac位点。对其中150个蛋白质的231个Kac位点进行肽段定量研究,与静息的HSCs相比,在活化的HSCs中有109个蛋白质的乙酰化肽段数目增加,18个蛋白质的乙酰化肽段数目减少,并涉及多种GO分类和KEGG通路。乙酰化蛋白质广泛定位于胞质(38.1%)和线粒体(30.2%)。基于GO富集的聚类分析显示Kac位点主要与能量代谢相关;基于KEGG通路的聚类分析显示这些蛋白质广泛参与三羧酸循环,与线粒体关系密切。结论首次对HSCs的Kac蛋白质进行质谱分析,并对发生乙酰化的蛋白质位点进行量化鉴定,为揭示蛋白质乙酰化在HSCs活化过程中的作用提供了一定的基础,并为抑制肝纤维化提供了潜在的分子靶标。