自噬相关5蛋白对刚地弓形虫刺激树突状细胞成熟的影响

目的探讨自噬相关5 (ATG5)蛋白对刚地弓形虫(简称弓形虫)体外刺激树突状细胞(DCs)成熟的影响。方法采用TRIzol法提取昆明小鼠总RNA,反转录为cDNA,经PCR扩增获得ATG5基因。构建重组质粒pET-32a-ATG5,转入大肠埃希菌Rosetta株中表达,尿素纯化后用抗His标签单抗蛋白质印迹(Western blotting)鉴定ATG5。分离鼠源DCs,用弓形虫体外感染DCs。感染实验分为3组:对照组(仅含DCs)、弓形虫组(弓形虫+DCs)和ATG5蛋白组(ATG5蛋白+弓形虫+DCs),每组设3次重复,各组弓形虫速殖子(1×10~4个)同时加入到DCs中, 37℃、 5%CO2共培养2 h。其中, ATG5蛋白组弓形虫在感染DCs前,预先与ATG5蛋白(50μg)在体外作用2 h。采用流式细胞术检测CD11cCD83双表达成熟型DCs在细胞总数中比例的变化,分析DCs的成熟情况,评价ATG5蛋白对弓形虫体外刺激DCs成熟的影响。结果ATG5扩增产物约为729 bp,ATG5蛋白相对分子质量(M_r)约为46 000。Western blotting检测结果显示,重组ATG5蛋白具有良好的反应原性。流式细胞术结果显示,对照组、弓形虫组、 ATG5蛋白组中CD11cCD83双表达成熟型DCs在细胞总数的比例分别为(13.3±0.5)%、(52.5±0.3)%和(47.8±0.6)%,弓形虫组和ATG5蛋白组差异有统计学意义(P <0.01),对照组与其他两组的差异有统计学意义(P <0.01)。结论ATG5蛋白可降低弓形虫体外刺激DCs成熟的能力。