慢性乙肝患者血清趋化因子MCP-1浓度与病毒载量关系的研究

目的 研究慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血清中单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的表达水平与HBV DNA载量之间的相关性.方法 用ELISA检测CHB患者和健康对照者血清中的MCP-1 蛋白浓度,以实时荧光定量PCR检测CHB患者血清中HBV DNA拷贝数.结果 CHB组血清中MCP-1浓度是157±80 ng/L,健康对照组MCP-1浓度是265±44 ng/L,CHB组血清中MCP-1浓度显著低于健康对照组,t=5.355,P＜0.001,差异有统计学显著性意义;CHB患者血清中MCP-1浓度与血清中HBV DNA拷贝数呈负相关（r=-0.602,P＜0.001）.CHB患者血清中MCP-1的浓度是降低的,MCP-1浓度与血清中HBV DNA 载量之间呈负相关（r=-0.602,P＜0.001）.结论 乙肝病毒与宿主细胞相互作用下调机体MCP-1表达,可能对HBV致病机理的研究提供一个新的视点.

融合蛋白d-EGF的结构预测及其意义

目的对融合蛋白d-EGF二级、三级结构进行预测，为构建相应结构重组分子的可能性提供理论指导。方法以融合蛋白基因序列为基础。用DNAStat软件预测其蛋白质的二级结构；用InsightII软件对其三级结构进行建模预测。结果DNAStar软件的GamierRobson方法预测融合蛋白d-EGF含较多争折叠结构；ChargeDensity-Charge显示其3～22，31～48区段含丰富的正电荷。Insight II软件对其三级结构进行建模显示融合蛋白d-EGF存在一个由六个链内二硫键组成曲结构域，同时存在3个反向平行的β-折叠结构，这些结构是融合前β-defensin-3，EGF两分子生物学活性所必需的部分。结论融合蛋白d-EGF的二、三级结构预测结果显示该组合分子可能具有β-defensin-3，EGF两种分子的功能，该方法可以为构建具有相应结构重组蛋白的可能性提供理论基础。

人β-防御素-3与人表皮生长因子融合蛋白的克隆及原核表达

目的:克隆融合蛋白d-EGF成熟链基因,构建原核表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)表达体系中进行有效表达、分离纯化并鉴定其特异性。方法:以蛋白基因序列为基础,RT-PCR扩增人防御素-β和表皮生长因子基因,分别构建β-防御素-3(β-defensin-3)、EGF重组质粒,应用重组PCR方法,将EGF的DNA序列拼接到β-defensin-3 DNA序列的3'端,将基因克隆入原核表达载体pET-SUMO,构建重组质粒pET-SUMO-d-EGF。采用PCR、测序等方法鉴定后转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni-trap柱纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果,最后以Western blot对其进行特异性鉴定。结果:成功构建β-defensin-3、EGF重组质粒,经重组PCR成功扩增出294 bp的目的片段,重组体PCR结果与预期结果一致,测序正确。转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导经SDS-PAGE分析得到28 kDa左右的目的蛋白条带。Western blot鉴定出融合蛋白含有抗EGF、β-防御素-3两种抗原特异性的蛋白。结论:成功构建原核表达载体pET-SUMO-d-EGF,并获得纯化的融合蛋白,为进一步的活性分析奠定了实验基础。