胆巴浸泡附子的工艺研究

目的:探究附子炮制过程中胆巴浸泡工艺对附子生物碱的影响,确定最佳的工艺参数。方法:从胆巴水溶液的浓度、附子在胆巴水溶液中的浸泡时间、附子与胆巴水溶液的料液比三个方面进行单因素考察,参照《中国药典》2020年版附子的含量测定方法,采用高效液相色谱法对附子中的生物碱含量进行测定,分析附子中生物碱的含量变化。结果:附片中双酯型生物碱含量随着泡胆时间增加、胆巴水溶液料液比减小和胆巴水溶液浓度增大,总体呈下降趋势;单酯型生物碱的含量变化无明显规律;总生物碱含量均呈下降趋势。综合附子的形态和生物碱含量,确定胆巴浸泡的最佳工艺为35%-40%胆巴水溶液浓度,以1∶2的料液比浸泡附子不少于20 d。结论:胆巴浸泡能有效保存附子,并能够降低其有毒成分双酯型生物碱的含量,优选的浸泡工艺可为胆巴炮制附子规范提供参考。

蒲黄中1种新染色掺假色素的确认及9种橙黄色色素的检测方法研究

目的:确认蒲黄中1种新染色掺假色素,并建立同时检测9种橙黄色色素的方法。方法:采用薄层色谱法(TLC)和液相色谱-质谱联用法对新染色掺假色素进行确认;采用TLC和高效液相色谱法(HPLC)检测9种橙黄色色素:色谱柱为Welch AQ-C18,流动相为乙腈-0.05 mol/L乙酸铵溶液(梯度洗脱),流速为1.0 m L/min,检测波长为432 nm(柠檬黄、皂黄、金橙O、碱性橙Ⅱ)和484nm(日落黄、酸性橙Ⅰ、金橙Ⅱ、橙G、碱性橙21),柱温为35℃,进样量为10μL。结果:金胺O、柠檬黄和新染色掺假色素TLC图斑点清晰,分离度好,阴性对照无干扰;新染色掺假色素为皂黄。柠檬黄、日落黄、橙G、酸性橙Ⅰ、金橙Ⅱ、金胺O、皂黄、碱性橙21和碱性橙Ⅱ的TLC图斑点清晰,分离度好,阴性对照无干扰;检测限分别为0.30、0.20、0.33、0.16、0.19、0.19、0.31、0.26、0.30mg/kg。结论:本研究所建方法可快速准确地对蒲黄中染色掺假色素和橙黄色色素进行定性检测。

双启动子DNA疫苗载体pCMVnir的构建及其启动子的活性

目的:研制携带CMVie和NirB两种双启动子的DNA疫苗新型载体pCMVnir(pCN)。方法:设计细菌IVI启动子nirB,置换pTriEx鄄4中p10和T7lac启动子,获得pCN,将报告基因pEGFP鄄N1和pDsRed2鄄N1分别插入pCN构建成pCN鄄EGFP和pCN鄄DsRed两种报告质粒,转化减毒沙门菌SalmonellaSL3261和大肠杆菌DH5α;同时采Fugene脂质体,转染Hela细胞和前列腺细胞,检测pCN启动子的活性。结果:pCN的两个启动子都可高效转录和表达两种荧光报告基因,并且nirB是温和厌氧依赖性的。结论:成功构建了一种双启动子DNA疫苗表达载体pCN。

酸性铬蓝K分光光度法测定附子不同炮制品中的镁含量

目的:建立酸性铬蓝K分光光度法附子不同炮制品中镁的含量。方法:采用酸性铬蓝K分光光度法测定附子不同炮制品中药材及煎煮液中镁的含量和溶出率,并对该实验的实验条件进行选择。结果:附子不同炮制品中镁含量由高到低依次为:盐附子>白附片>黑顺片>生附子;附子各炮制品镁的溶出率比较接近。结论:本方法简便、准确、可靠,可用于附子及其炮制品中镁含量的质量控制。

EDTA滴定法测定附子不同炮制品中的钙元素含量

目的:建立EDTA滴定法测定附子不同炮制品中钙元素的含量。方法:采用EDTA滴定法测定附子不同炮制品中药材及煎煮液中钙元素的含量和溶出率,并对该实验的实验条件进行选择。结果:附子不同炮制品中钙元素由高到低依次为:盐附子>黑顺片>白附片>生附子;溶出率由高到低依次为盐附子>白附片>黑顺片>生附子。结论:本方法简便快捷,为附子不同炮制品钙元素含量测定提供了研究依据。

河北省植棉区覆膜和无膜栽培对棉花产量性状及纤维品质的影响

棉花无膜栽培可从源头控制地膜使用,是有效解决棉田残膜污染的方法之一。通过覆膜和无膜栽培对不同生育期的6个棉花品种产量性状和纤维品质的影响研究表明,无膜栽培模式下棉花单株果枝数、单株结铃数、霜前花率和籽棉产量都有不同程度的降低;对棉花纤维品质的影响比较复杂,因品种而异。综合分析得出,无膜栽培对生育期在120~122 d的中早熟棉花品种影响最小,较适宜在河北植棉区无膜种植。研究结果可为棉花无膜栽培技术的推广提供依据。

仙灵骨葆胶囊联合保妇康栓防治萎缩性阴道炎临床疗效分析

绝经女性由于雌激素水平下降，易反复发生萎缩性阴道炎，针对病因的激素替代疗法（HRT）副作用大，禁忌症多；单纯西药抗炎治疗易复发。近几年，含有植物雌激素的补肾中药，因其对人体的弱雌激素作用和较少的毒副作用，正被探索用于取代HRT，仙灵骨葆胶囊含有黄酮类植物雌激素，不但具有类雌激素作用，还具有调节垂体-性腺轴内分泌机能、

HPLC法快速测定5-氟尿嘧啶血药浓度

目的 :建立反相高效液相色谱法测定人血清中 5 -氟尿嘧啶浓度。方法 :血清样品用乙酸乙酯提取 ,水浴氮气吹干 ,残留物用水溶解后进样。色谱柱为C1 8柱 (2 5 0mm× 4 6mm) ,水为流动相 ,流速 1 0mL·min- 1 ,紫外检测波长 2 73nm ,桂皮酸为内标。结果 :本法最低检测浓度为 0 0 5 μg·mL- 1 ,线性范围为 1 0～ 5 0 0 μg·mL- 1 ,日内RSD为 2 7%～ 4 1% ,日间RSD为 3 8%～ 4 7(n =4)。结论 :该法适用于 5 -氟尿嘧啶的药代动力学研究及临床血药浓度检测。试验结果表明 ,该方法经济、简便、快速、灵敏度高、重现性好。

人ODC基因第三外显子反义RNA腺病毒载体的构建

目的:构建人鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因第三外显子反义RNA的腺病毒载体。方法:RT-PCR方法克隆出人ODC基因第三外显子的片段,插入pMD18-T载体中,经SalⅠ、BglⅡ酶切,插入穿梭质粒pAd-Track-CMV形成重组质粒pAdTrack-CMV-ODCr。经PmeⅠ酶切线性化后,转入pAdesy-1细菌中与含腺病毒基因骨架的质粒pAdesy-1同源重组。将重组质粒pAdesy-ODCr经PacⅠ酶切后,转染293细胞包装成腺病毒颗粒,经荧光显微镜和PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。结果:用RT-PCR方法从人前列腺癌组织中扩增出120bp的cDNA片段,经测序证实为ODC基因第三外显子的片段。重组质粒pAdTrack-CMV-ODCr转入pAdesy-1细菌中获得多个阳性克隆。重组质粒pAdesy-ODCr转染293细胞进行包装,经荧光显微镜观察可见其在293细胞中表达。进一步通过PCR法证实其含有目的基因。结论:成功地构建了ODC基因第三外显子反义RNA重组腺病毒载体,为研究其抗肿瘤的作用奠定了基础。

附子正丁醇萃取物的化学成分

目的研究附子正丁醇萃取物的化学成分。方法采用色谱技术进行分离纯化,利用理化性质及波谱技术鉴定化合物结构。结果从附子的正丁醇萃取物分离得到9个生物碱,分别鉴定为尼奥灵(1)、附子灵(2)、异塔拉定(3)、subcusine(4)、塔拉萨敏(5)、川附子碱A(6)、易混翠雀花碱(7)、14-acetylkarakoline(8)、delstaphisine 8,14-deacetate(9)。结论化合物9为新天然产物,化合物8为首次从该属中分离得到,化合物6和7为首次从该植物中分离得到。

盐附子漂洗过程中钙离子含量的测定方法

对钙离子含量测定的方法进行优化,建立有效的测定盐附子漂洗液胆巴含量（以钙离子计）的方法。比较高温炽灼和微波消解2种样品前处理方法的差异,并对EDTA—滴定法进行改进,采用离子色谱法和EDTA—滴定法同时测定盐附子漂洗液中钙离子质量浓度。微波消解法在样品前处理上不仅安全而且高效、快速,能替代高温炽灼法作为滴定法样品处理的新方法;加入酒石酸作为掩蔽剂的滴定法比其他2种方法在测定钙离子质量浓度时更加精确,其测定结果为2.17-3.32g/L,离子色谱法测定结果为1.90-3.27g/L,2种方法没有明显差异,均为有效的测定方法。优化建立的方法高效、快速、准确可靠,可作为盐附子漂洗液中胆巴含量的测定方法,并建立了离子色谱法与微波消解-EDTA滴定联合测定钙离子质量浓度的方法 。

减毒沙门氏细菌为载体的人乳头瘤病毒双启动子DNA疫苗载体构建

目的 :构建一种廉价高效的防治宫颈癌的人乳头瘤病毒新型双启动子DNA疫苗。方法 :设计合成细菌厌氧诱导启动子Nir ,含有FNR顺式反应元件、RBS和真核基因Kozak元件 ,插入pTriEx真核启动子CMVIE下游 ,构建pCMVnir双启动子载体。将人乳头瘤病毒 16型L1L7,融合基因 ,插入pCMVnir,制备pCMVnirL1E7,转化减毒沙门氏细菌SL32 6 1,厌氧诱导表达 ,SDS PAGE和Westernblot分析检测Nir启动子的活性。结果 :经DNA序列和限制性内切酶鉴定分析 ,成功构建了HPV双启动子DNA疫苗载体pCMVnirL1E7,转化沙门氏细菌SL32 6 1,厌氧条件下可诱导表达HPVL1E7蛋白质。结论 :成功构建了一种与胞内寄生细菌(减毒沙门氏细菌 )匹配的双启动子DNA疫苗新型载体 。

HPV16L1E7的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:研究人乳头瘤病毒(HPV)的主要衣壳蛋白L1和主要的转化蛋白E7的融合基因在原核细胞中的表达,为研制HPV16L1E7疫苗和诊断试剂盒提供依据。方法:采用聚合酶链反应(PCR)以重组质粒pUC19L1E7为模板扩增HPV16L1E7基因片段,克隆至载体pMD18-T中,并用限制性内切酶将HPV16L1E7基因切下,克隆至原核表达质粒pQE30中,经IPTG诱导表达,再使用SDS-PAGE和蛋白印迹检测其抗原性和表达水平。结果:HPV16L1E7融合蛋白能被抗HPV16L1抗体识别,分子量为66KD,经IPTG诱导4h后,表达的HPV16L1E7融合蛋白占菌体总蛋白量的25%以上。结论:成功构建的表达载体pOE30-L1E7可在原核表达细胞中高效表达,且表达出的HPV16L1E7融合蛋白具有反应活性,可与HPV16抗体发生反应。

携带双启动子DNA疫苗载体的减毒沙门菌在体内定植及动态变化

目的:探讨双启动子DNA疫苗载体在减毒沙门菌中的稳定性和重组减毒沙门菌在小鼠体内的定植及动态变化。方法:将人乳头瘤病毒双启动子DNA疫苗载体pCN鄄16L1E7转化减毒沙门菌S.SL3261熏经口服、鼻饲和皮肤途径免疫小鼠,在免疫后的第3、4、5、6周取小鼠粘膜相关淋巴组织,电镜观察细菌在组织中的定植;组织匀浆,细菌培养计数确定细菌的增殖;从细菌中提取质粒酶切鉴定以确定质粒的稳定性。结果:重组减毒沙门菌S.SL3261能在小鼠脾脏、肝脏和粘膜相关淋巴组织中定植,电镜可检测到多个细菌定植灶;重组减毒沙门菌可有效进入机体细胞并有限增殖达6周,在第4～5周菌落数量达到高峰,然后逐渐减少以至最后被清除。pCN鄄16L1E7可在减毒沙门菌中稳定存在,载体的产量和酶切图谱没有明显变化。结论:双启动子DNA疫苗载体pCN鄄16L1E7与减毒沙门菌有较好的相容性,能够在小鼠体内定植及有限增殖。口服、鼻饲和皮肤粘膜接种途径均可有效地将减毒沙门菌携带的DNA疫苗载体导入粘膜相关淋巴组织。

通过T-A克隆技术构建含免疫刺激序列CpG基序的抗SBR DNA疫苗(英文)

目的 :构建含免疫刺激序列、能够阻止变形链球菌在牙面粘附的防龋DNA疫苗。方法 :根据原核表达质粒 pS BR CTA2 B基因序列 ,设计针对编码变形链球菌表面蛋白抗原AgⅠ /Ⅱ分子中唾液蛋白结合区段 (SBR)的特异性PCR引物 ,利用PCR技术由质粒 pSBR CTA2 B扩增目的DNA片断 ;通过T A克隆技术将目的DNA片段克隆于中间载体 pMD1 8 T ,鉴定插入方向后 ,选择插入方向正确的克隆 ,将目的DNA从中间载体释放 ,再克隆至含有CpG免疫刺激序列的真核表达载体pcDNA3 1。结果 :通过对重组质粒pcDNA3 1 SBR进行酶切图谱分析和DNA序列测定分析 ,证明真核表达重组质粒 pcD NA3 1 SBR构建成功、开放阅读框架正确。结论 :利用T A克隆等技术可成功将编码SBR的DNA片段克隆到含有免疫刺激序列CpG的真核表达载体 pcDNA3 1的适当部位 ,构建出真核表达重组质粒pcDNA 3 1

人ODC重组蛋白及其多抗的制备和临床应用

目的 :构建鸟氨酸脱羧酶 (ODC)表达载体 ,表达ODC重组蛋白 ,制备其多克隆抗体并观察其在大肠癌诊断中的意义。方法 :从大肠癌组织中提取总RNA ,反转录PCR法扩增全长ODCcDNA ,将扩增的基因插入表达载体 pQE 30的BamHI和SalI酶切位点之间 ,DNA测序验证插入片段。将重组载体转化入宿主菌M 15中进行诱导表达 ,产生含 6 His tag的融合蛋白。WesternBlotting法检测表达蛋白。亲和层析法纯化融合蛋白 ,以该蛋白免疫小鼠制备多抗 ,免疫组化检测大肠癌组织中ODC的表达水平。结果 :酶切鉴定和DNA测序显示ODC重组表达载体中含有人ODCcDNA全长序列 ,与NIH基因库的人ODCcDNA比较有 99%的同源性。将该重组载体转化入大肠杆菌M 15中表达所得蛋白经WesternBlotting验证为目的蛋白。纯化融合蛋白 ,免疫小鼠获得多抗效价较高。免疫组化检测大肠癌组织中ODC的表达显示该抗体检测效果较好 ,大肠癌组织中ODC的表达水平明显高于正常组织 (P <0 .0 5 )。结论 :成功地构建了ODC表达载体、表达出ODC重组蛋白、制备出ODC多克隆抗体 ,为进一步研究结直肠癌的发病机理及其诊断和治疗方法打下了良好基础。

用逐一布线法获取探槽地层缩短量——以博—阿断裂中东段为例

前人对于逆断层探槽近地表缩短量的研究方法主要是依托于角度长度的分段测量数据,依据理论模型计算其缩短量数值。以博—阿断裂中东段托尔逊南苏巴什活动背斜北翼的一个探槽为例,采用逐一布线拟合地层挠曲的方法获取的总缩短量,并与理论模型计算值进行对比。通过分析得知此方法可行且在数据精度上可靠程度更高。

仙灵骨葆对绝经女性阴道脱落细胞成熟指数的影响

目的通过对绝经期女性服用仙灵骨葆前、后阴道脱落细胞成熟指数(MI)的比较观察,探讨补肾中药用于防治萎缩性阴道炎的可行性。方法选取62例绝经女性,给予口服仙灵骨葆胶囊3粒每日2次,1个月后改为2粒每日1次,继用2个月停药,用药前、后行阴道涂片,检测上皮细胞MI,比较用药前后阴道黏膜的雌激素影响程度。结果所有患者用药后3个月,MI均有不同程度右移,雌激素影响程度提高。结论仙灵骨葆可提高绝经女性阴道上皮细胞雌激素影响,从而提高阴道自洁能力,对萎缩性阴道炎的防治具有一定的效果。

含有弓形虫表面抗原P22、P30复合基因的载体构建

目的 选择弓形虫表面抗原P2 2、P30的有效基因片段 ,共同构建在同一克隆载体pUC19和表达载体 pGE MEXTM- 1上 ,并保证其连接方向及开放读码框的正确。方法 根据已发表P30基因序列 ,用PCR技术调取所需基因片段 ,P2 2基因片段来自重组质粒pGEX - 2T -v2 2 ,将两片段定向克隆于克隆载体 pUC19及表达质粒pGEMEXTM- 1上 ,用酶切及测序的方法对重组子进行鉴定。结果 酶切产物经电泳显示条带清晰 ,P2 2、P30基因片段的泳动位置分别在 4 4 6bp和 86 0bp的位置 ,与预计结果一致 ;测序结果表明插入的复合基因片段方向及序列均正确。结论 成功构建的含有P2 2、P30基因片段的质粒重组体 ,保证了两基因连接方向、序列及开放读码框的正确 ,为今后两基因的进一步复合表达研究奠定了基础。