利用毒素蛋白基因ccdB构建高效低背景T-载体

高效低背景T-载体的构建可显著提高克隆PCR产物的效率。笔者介绍1种在实验室常规条件下简单快捷制备高效低背景T载体的方法。将含有限制酶Xcm I酶切位点的ccd B致死基因作为插入DNA片段连接到p MD19-T Simple Vector骨架上得到重组质粒,通过菌落PCR、酶切分析及测序验证正确的重组质粒经限制酶Xcm I酶切即得到T-载体。该T-载体含有的ccd B致死基因可以降低载体自连的背景干扰,提高了T-A克隆效率,具有较高的阳性克隆率,继承了p MD19-T Simple Vector的优点,与普通T-载体相比,还具有高效、低背景的优越性。整个操作过程简易可行,具备一定的应用前景。

基于单分子实时测序的金花茶全长转录组分析

金花茶是中国特有植物,是培养黄色山茶花的珍贵种质资源,具有重要的观赏价值和药用价值。金花茶全长转录组测序数据有助于筛选出调控花色合成的基因,但是金花茶的全长转录组数据仍然缺乏。因此,本研究利用单分子实时测序技术对金花茶花芽、花蕾以及盛开的花进行混合样品的全长转录组测序。测序结果表明,在28.2 Gb的原始测序数据中,共生成了179645个全长非嵌合序列(FLNC),从中获得了45372个高质量的全长转录本(Isoform)。对获得的全长转录本进行可变剪切分析及长链非编码RNA预测,鉴定出了7752个可变剪接事件和1730个长链非编码RNA序列;在基因注释分析中,NR、Swiss-Prot、KOG和KEGG数据库分别注释了43348、36909、29452和42163条转录本,检测到了1787个转录因子。GO注释及KEGG代谢通路分析表明,金花茶的花芽、花蕾、开放花朵等组织的基因表达谱主要与次生代谢物质合成、细胞功能以及细胞组分合成有关。本研究提供了大量的全长转录本序列,为今后金花茶的分子生物学和遗传学研究奠定了基础。

金花茶叶绿体基因组密码子偏好性分析

为揭示金花茶叶绿体基因组的密码子偏好性和相关指标变化,探讨适合金花茶叶绿体基因组表达的最佳密码子,本研究利用R语言和Codon W、Microsoft等软件,对金花茶叶绿体基因组中52个编码基因(coding sequence,CDS)的密码子使用模式进行了研究。结果表明,在金花茶叶绿体基因组中,同义密码子的使用偏好以A/U结尾,特别是以U结尾;有效密码子数(effective number of codon,ENC)均大于35,属于弱偏好性;密码子第3位的碱基组成同第1位和第2位存在显著差别,密码子第3位核苷酸的组成对密码子使用偏好性的影响较之其他位点更为重要;除自然选择之外,密码子偏好性还受到突变压力和核苷酸组成等因素的影响;共有16个密码子被鉴定为金花茶叶绿体基因组最优密码子。本研究为金花茶叶绿体基因组的遗传修饰和系统发育研究提供参考。

牛大力苯丙氨酸解氨酶的克隆和生物信息分析

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)是苯丙烷代谢途径的关键酶,在植物的类黄酮类物质的合成起着重要作用。为了研究牛大力PAL的功能,本研究利用RT-PCR技术从牛大力的根中克隆获得1个苯丙氨酸解氨酶基因,命名为MsPAL1。基因结构分析表明,该基因开放阅读框为2157 bp,编码719个氨基酸,蛋白质分子量为78.8 kD,理论等电点为6.23;MsPAL1蛋白具有苯丙氨酸解氨酶特异性特征序列(G-[STG][LIVM]-[STG]-[AC]-S-G-[DH]-L-X-P-L-[SA]-X(2)-[SAV]);MsPAL1蛋白的空间结构模型分析显示MsPAL1为同型四聚体,每个单体均由MIO结构域、核心域和插入的屏蔽域组成,其中MIO区中含有高度保守的Ala-Ser-Gly三联体活性位点。进化树分析表明,MsPAL1与豆科植物鹰嘴豆和蒺藜苜蓿的亲缘关系较近,同归属于双子叶分支。荧光定量结果显示MsPAL1主要在牛大力不同组织的表达丰度为:不定根>块根>叶>茎,其中不定根中的表达量显著高于块根,而叶和茎中的表达无显著性差异。本研究结果为进一步了解PAL基因在牛大力类黄酮类物质积累的分子机制提供理论依据。