RNA干扰下调MBP-1对骨肉瘤Saos-2细胞生物学的影响

目的探讨c-myc启动子结合蛋白1(MBP-1)基因沉默对人骨肉瘤Saos-2细胞生长的影响。方法实验分为3组:正常对照组(未转染骨肉瘤细胞)、阴性对照组(转染错义序列组)和沉默组(转染MBP-1 sh RNA组)。设计2条MBP-1基因的RNA干扰片段及1条阴性对照si RNA,并与p SIREN-retro Q质粒连接。将重组p SIREN-retro Q质粒通过Lipofectamine 2000脂质体转染骨肉瘤Saos-2细胞。实时PCR和Western blot分别检测MBP-1表达。CCK-8法对MBP-1沉默后骨肉瘤Saos-2细胞生长进行检测。Western blot检测对照组和沉默组cyclin D1和cyclin E的表达。结果通过PCR扩增及测序,说明已成功构建MBP-1沉默及对照重组p SIREN-retro Q质粒。实时PCR结果显示,沉默组MBP-1 m RNA相对表达量与对照组相比显著下调(P<0.05)。Western blot结果显示,沉默组MBP-1蛋白表达量与对照组相比也显著下调。CCK-8法结果表明,沉默组细胞在48、72和96 h时增殖能力均比对照组显著升高(P<0.05)。沉默组cyclin D1和cyclin E的表达显著高于对照组(P<0.05)。结论 MBP-1基因沉默后骨肉瘤Saos-2细胞生长被明显促进,为寻找骨肉瘤基因治疗新靶点打下基础。

RNA干扰MBP-1基因对胃癌细胞SGC-7901增殖影响

目的探讨MBP-1(c-myc promter binding protein 1,MBP-1)基因表达沉默对胃癌细胞株SGC-7901细胞增殖影响。方法实验分3组:空白对照组(未转染胃癌细胞)、阴性对照组(转染错义序列)和干扰组(转染MBP-1shRNA)。设计2条针对MBP-1基因的小干扰RNA片段及1条阴性对照siRNA,并构建入pSIREN-retroQ质粒。将构建的重组pSIREN-retroQ质粒通过Lipofectamine 2000脂质体转染胃癌SGC-7901细胞,嘌呤霉素筛选稳转株细胞。Real time PCR和Western blot分别检测MBP-1表达。MTT法对MBP-1干扰后SGC-7901细胞增殖进行检测。结果通过PCR扩增阳性克隆及测序,说明已成功构建MBP-1干扰及对照重组pSIREN-retroQ质粒。通过Lipofectamine 2000脂质体将重组质粒转染胃癌SGC-7901细胞,并通过嘌呤霉素筛选2周,说明已成功构建MBP-1干扰及对照SGC-7901稳转株细胞。Real time PCR检测,干扰组MBP-1mRNA相对表达量与空白对照组相比显著下调(P<0.05)。Western blot检测MBP-1蛋白表达,干扰组MBP-1表达量与空白对照组相比也都显著下调。MTT法检测结果表明,MBP-1干扰组细胞在48、72、96和120h增殖能力比空白对照组都有显著的升高(P<0.05)。结论下调MBP-1基因表达能明显促进胃癌细胞SGC-7901的增殖,从而为胃癌基因治疗提供了新靶点。

siRNA沉默PIM1基因表达对人胃癌MKN-45细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨PIM1基因沉默对人胃癌MKN-45细胞增殖和凋亡的影响。方法:设计2条针对PIM1 mRNA靶序列的干扰RNA正义链和反义链及阴性对照序列,构建重组pSIREN-retroQ质粒载体,并转染胃癌MKN-45细胞。应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别检测PIM1在mRNA水平及蛋白水平的表达。CCK-8法检测胃癌MKN-45细胞的增殖,流式细胞分析胃癌细胞的凋亡,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白Caspase 3和Caspase 9的表达。结果:重组克隆通过PCR扩增及测序,证明干扰序列插入正确。与正常对照组和阴性对照组相比,两个RNA干扰组胃癌MKN-45细胞PIM1在mRNA及蛋白水平的表达量都显著降低(P<0.05),细胞增殖能力下降(P<0.05)。此外,干扰组细胞凋亡明显增多(P<0.01),Caspase 3和Caspase9蛋白表达上调(P<0.01)。结论:PIM1 siRNA能有效下调靶基因表达,产生特异性基因沉默效应;PIM1基因沉默显著抑制胃癌MKN-45细胞的增殖并促进其凋亡。