肺癌干细胞的球体形成与致瘤性分析

目的：从人肺腺癌细胞株SPC—A1中诱导球体形成，对其中的肺癌干细胞进行鉴定并评估其致瘤能力。方法：无血清条件下培养肺癌细胞，采用表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、重组人胰岛素样生长因子-1（insulin—like growth factor-1，IGF-1）和重组人成纤维细胞生长因子-10（fibroblast growth factor—10，FGF-10）等细胞生长因子诱导球体形成，球体细胞采用RT—PCR及免疫荧光技术检测干细胞相关标志的表达，并通过NOD—SCID小鼠移植评估其致瘤性。结果：SPC—A1肺腺癌细胞经培养5—10d后，即可形成悬浮生长的细胞球体（肺球体）。RT—PCR检测显示肺球体细胞表达肺癌干细胞表面标志CD24和CD221．细支气管肺泡干细胞标志Clara细胞分泌蛋白和肺泡活性蛋白C，胚胎干细胞主干基因OCT4、Nanog和Bmi-1，以及肺干细咆主干基因甲状腺转录因子-1。采用免疫荧光检测其中3个标志的蛋白表达，证实80％以上的肺球体细胞呈Clara细胞分泌蛋白、肺泡活性蛋白C和OCT4染色阳性。肺球体细胞具有高致瘤性，在NOD—SCID小鼠中移植5103个细胞即可形成肿瘤。结论：肺球体细胞中肺癌干细胞高度富集并具有致瘤性。

micro-CT法观测雌性小鼠股骨骨参数的分析

目的 利用小动物CT（micro-CT）收集正常雌性BALB/c-nu/nu小鼠与BALB/c小鼠股骨的影像学数据.方法 BALB/c-nu/nu小鼠与BALB/c小鼠各15只,雌性,10～12周龄,取股骨后用micro-CT进行扫描,将得到的数据进行系统分析.结果 成功收集了正常雌性BALB/c-nu/nu小鼠与BALB/c小鼠股骨的CT影像学数据.通过数据分析,发现两者在皮质骨相对骨体积上具有显著差异,在骨小梁相对骨体积、骨表面积与组织体积比值和骨密度也有显著差异.结论 micro-CT可以对雌性小鼠股骨的各项参数进行定量分析.

人肺腺癌干细胞的分离及鉴定

目的:从人肺腺癌细胞株中分离及鉴定具有干细胞特征的高致瘤性癌干细胞。方法:采用磁性细胞分选(magnetic activated cell sorting,MACS)技术将肺腺癌细胞分成多个亚群,然后应用流式细胞及RT-PCR技术检测干细胞相关标志表达,通过NOD-SCID小鼠移植评估其致瘤性。结果:在A549和SPC-A肺腺癌细胞中发现一个新颖的癌细胞亚群,此类癌细胞的表型特征为CD24+IGF-1R+,具有高侵袭性和高致瘤性,在NOD-SCID小鼠中仅需移植100个细胞即可形成肿瘤,其致瘤能力是上述标志阴性细胞的1000倍。此外,这些细胞表达胚胎干细胞标志(OCT4和Bmi-1)及肺干细胞标志(CCSP,SP-C,TTF-1和Gremlin),类似小鼠肺脏细支气管肺泡干细胞(bronchioalveolar stem cells,BASC),并具有自主生长特性,能够在无血清条件下长期培养。结论:人体肺腺癌中CD24+IGF-1R+细胞属于BASC样癌干细胞。

血清循环DNA的EGFR基因突变与肺癌选择性靶向治疗研究

目的:通过血清循环DNA的基因突变检测,筛选EGFR突变型肺癌患者并评估靶向性药物吉非替尼对其的临床疗效。方法:从肺癌患者血清中提取DNA,采用PCR扩增和基因测序检测EGFR突变。结果:116例肺癌血样中检出EGFR突变46例,突变率为39.7%,其中外显子19和21突变分别占65.2%(30/46例)和34.8%(16/46例),EGFR基因突变多见于女性患者和肺腺癌(包括腺鳞癌)患者。对20例肺癌的进一步分析证明,血清EGFR基因突变类型与患者自身肿瘤的突变类型相同。另外通过血清循环DNA基因检测法筛选了19例化疗失败的突变型晚期肺癌进行吉非替尼靶向治疗,客观有效率为52.6%,病情控制率为89.5%,中位无进展生存时间为8个月,中位生存时间为12个月,2年生存率达到33.3%。结论:证实血清循环DNA与肿瘤组织DNA的EGFR基因突变一致;以血清循环EGFR突变检测结果为依据选择分子靶向性药物吉非替尼治疗,对晚期肺癌患者疗效明显。

评多项肿瘤标志物检测对肝癌的诊断价值

本研究检测了１４８５例良恶性肝病患者血清ＡＦＰ及其变异体（ＡＦＰ－ｖ）、γ－谷氨酰转肽酶同工酶（ＧＧＴ）和α１抗胰蛋白酶（ＡＡＴ）浓度。４７４例肝癌患者的上述四项标志物水平显著高于１０１１例非癌肝病患者。估测到ＡＦＰ、ＡＦＰ－ｖ、ＧＧＴ和ＡＡＴ的诊断准确度分别为０．８７３、０．８７１、０．９４８和０．９３８。诊断的特异性分别达到０．９５６、０．９９９、０．９９９和０．９９８；同时相应的灵敏度分别为０．６９６、０．５９９、０．８４０和０．８１０。ＧＧＴ和ＡＡＴ是检测ＡＦＰ阴性（＜２０μｇ／Ｌ）肝癌最有效的标志物，其阳性检出率高达９０％；而ＡＦＰ－ｖ是鉴别ＡＦＰ低水平异常升高的（在２０～４００μｇ／Ｌ）肝癌和非癌肝病患者的最佳指标。本研究结果充分证实联合检测多项肿瘤标志物对肝癌具有重要的诊断价值。

肺腺癌骨转移裸小鼠模型的建立及MicroCT观察

背景与目的骨转移占晚期肺癌的50%-70%。本研究以体外侵袭、迁移能力不同的肺腺癌细胞系A549、H1299、SPC-A-1、XL-2为基础建立肺腺癌骨转移裸小鼠模型,MicroCT观察骨转移情况。方法将50只6 w-8 w龄裸小鼠随机平均分为5组,4个实验组左心室分别注射相应四种细胞悬液(0.2 mL/只);对照组左心室注射等量生理盐水。注射后第二周起定期对各组小鼠进行MicroCT扫描,当小鼠明显消瘦时此组观察结束,结束前行骨组织病理学检查;对各实验组出现的骨转移部位按中轴骨和四肢骨归类,比较这两种部位之间的转移率;根据各组出现骨转移所用平均时间、骨转移率,对各细胞系骨转移能力进行统计分析。结果经MicroCT、病理学检查确定,各实验组出现不同骨转移率,对照组小鼠无骨转移现象;各实验组中轴骨转移率均明显高于四肢骨,这与临床上肺癌骨转移规律一致,模型建立成功。各实验组间发生骨转移的小鼠数目及出现转移所用平均时间无明显差异。结论MicroCT能清晰地检测到骨质破坏,利于骨转移情况的判断;我们成功建立了肺腺癌骨转移模型,为以后探索出新的肺腺癌乃至肺癌骨转移临床预防和治疗方案提供基础;4种肺腺癌细胞系体外侵袭、迁移能力强弱不等,但体内骨转移能力没有明显差异,其原因还有待进一步的探索。

人肺腺癌干细胞源自肺脏细支气管肺泡干细胞的初步研究

背景与目的已有的研究提示肺腺癌源自肺脏细支气管肺泡干细胞(BASC)的恶性转化,但该假说在人体中尚未得到证实。本研究旨在对人肺腺癌干细胞的BASC特征进行分析。方法人肺腺癌干细胞经流式细胞纯化或无血清悬浮培养获得,所得细胞采用免疫荧光检测BASC特征性标志并经尾静脉注射至免疫缺陷小鼠观察肿瘤转移。结果人肺腺癌细胞A549和SPC-A1均表达Ⅱ型肺泡细胞标志SP-C,但少数细胞表达支气管非纤毛柱状细胞标志CCSP和胚胎干细胞基因OCT4,提示此类细胞属于BASC样癌干细胞。采用流式细胞分选技术纯化其中的CD24+CD22+肺腺癌干细胞后,发现此类细胞属于CCSP+SP-C+OCT4+细胞,其表型与BASC相同。此外,肺腺癌细胞在无血清培养条件下经EGF/IGF-1/FGF-10刺激能够形成悬浮生长的球体,这类肺球体细胞的特征也与BASC相同。肺球体细胞在含血清条件下培养2周即发生分化,表现为CCSP和OCT4表达丢失。动物实验揭示肺球体细胞具有高转移能力。结论人肺腺癌干细胞具有BASC特征并表达胚胎干细胞基因OCT4,此类肺癌细胞可能与小鼠肺腺癌一样,源自肺脏BASC的恶性转化。

人肺腺癌干细胞对顺铂和卡铂的药物敏感度分析

目的:分析人肺腺癌干细胞(lung adenocarcinoma stem cell,LASC)对顺铂(cisplatin,DDP)和卡铂(carboplatin,CBP)的药物敏感度。方法:人肺腺癌细胞SPC-A1、AG及CPA-Y2经DDP和CBP作用后,应用CCK-8(cell countingkit-8)比色法检测细胞存活率,应用免疫荧光检测法测定药物生存细胞(drug surviving cell,DSC)的表型特征。通过磁性细胞分选技术分离肺腺癌干细胞,应用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)示踪技术检测DSC中的肿瘤干细胞,分析DSC对DDP和CBP的药物敏感度。结果:LASC具有细支气管肺泡干细胞(bronchioalveolar stem cell,BASC)表型(OCT4+CCSP+SP-C+)。将此类癌干细胞(CD221+)与肺腺癌分化细胞(CD221-)混合后检测DSC发现,后者具有OCT4+BASC表型。DSC对铂类药物具有显著抗性。结论:肺腺癌干细胞对DDP和CBP具有显著耐药性,可能是化疗后肿瘤复发的根源。

评价酶联免疫检测血清CYFRA21-1对非小细胞肺癌的诊断价值

目的评价检测ＣＹＦＲＡ２１┐１对非小细胞肺癌的诊断价值。方法用ＥＬＩＳＡ法测定７０例肺癌（ＬＣ）其中４７例非小细胞肺癌（ＮＳＣＬＣ），３例小细胞肺癌（ＳＣＬＣ）和２０例未分型肺癌、６４例肺部良性疾病患者及４０例健康人血清ＣＹＦＲＡ２１┐１浓度。试验的诊断性能用相对操作特征（ＲＯＣ）分析法估测之。结果测得全阈诊断准确率（ＯｖｅｒａｌＤｉａｇ┐ｎｏｓｔｉｃＡｃｃｕｒａｃｉｅｓ）ＬＣ为０．７５、ＮＳＣＬＣ为０．７６，ＳＱＣ为０．８３，ＡＤＥ为０．６７和ＳＣＬＣ为０．３８。在相应于特异性为０．９５的界定值３．４７μｇ／Ｌ处，各型的灵敏度分别为ＳＱＣ０．６２，ＬＣ０．５３，ＮＳＣＬＣ０．５１，ＡＤＥ０．４８和ＳＣＬＣ０．００。结论结果显示ＣＹＦＲＡ２１┐１是ＮＳＣＬＣ较灵敏和特异的一个标志物。未观察到ＴＮＭ各期间该标志物的平均水平有明显的差异；然而异常升高水平的患者的比例随病期的进展而显著增加，提示一系列检测ＣＹＦＲＡ２１┐１水平可能有助于监查ＮＳＣＬＣ患者的疗效。

非小细胞肺癌微切割组织中3p杂合性丢失的研究

目的:探讨微切割非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)组织中3p14.2和3p25等位基因的杂合性丢失(lossofheterozygosity,LOH)与NSCLC发生发展之间的相关性。方法:采用微切割技术和聚合酶链反应(PCR)结合二核苷酸(CA)n重复序列多态性方法,分析44例NSCLC石蜡切片中癌组织和非癌组织中3p14.2和3p25位点的杂合性丢失(LOH)。结果:在44例NSCLC中29例组织标本检测3p14.2位点的LOH,其丢失率为65.5%(19/29),而另外15例患者中3p25的LOH的丢失率为40.0%(6/15)。微切割的非癌组织均未见有3p的丢失,癌组织的3pLOH频率与肺癌组织学分类及TNM分期均无明显关系(P>0.05)。结论:NSCLC癌组织中普遍出现3p14.2及3p25杂合性丢失现象,从而提示该两处可能存在一个或多个与人体肺细胞癌变相关的抑癌基因。

中医药对乙型肝炎患者肝癌前期状态的干预研究

目的:探讨中药对乙型肝炎相关性肝癌的干预作用. 方法:在慢性乙型肝炎患者中,筛选出肝癌高危患者30 例,治疗组17例根据审因论治的原则,以中药制剂对其进行为期2 a的肝癌干预治疗;对照组13例以中西药进行常规保肝治疗．治疗过程中每月随访临床症状、体征、肿瘤标志物、肝功能、病毒载量及T细胞亚群等项目,定期进行B超和CT检查．结果:中药干预组肿瘤标志物甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体和γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ的转阴率分别为86％(6／7)、 83％(5／6)和82％(9／11),对照组中所有病例肿瘤标志物持续阳性,无1例转阴．2 a期间中药干预组累计肝癌发生率为 12％(2／17),对照组为85％(11／13),两者比较差异具有极显著性(P<0．0 001)．结论:中医“养正徐图”治则能有效降低肝癌高危患者肿瘤标志物水平,并能延缓或阻止肝癌的发生．

肺癌的多项肿瘤标志物诊断研究

肺癌的多项肿瘤标志物诊断研究陈书盘，关赛芳，陈复华，耿沁上海市肿瘤研究所（２０００３２）迄今，尚未确认单项肺癌（ＬＣ）相关标志物具有足够高的灵敏度（ｓｅ）和持异性（Ｓｐ）可满足临床确诊ＬＣ的要求。多项肿瘤标志物联合检测被认为是克服这一困难的一种可能的...

人源性胃癌移植瘤模型的初步建立及其评价

目的 将临床胃癌组织皮下移植于免疫缺陷小鼠,以建立人源性胃癌移植瘤模型,并对建成模型进行初步评价.方法 将98例手术切除的胃癌组织分别皮下移植于SCID小鼠体内,待移植瘤体积长至500～1 000 mm3时,取出肿瘤传代至BALB/c-nu/nu裸小鼠体内,同时进行速冻,石蜡包埋,冻存等样本组织库保藏.对石蜡包埋的组织进行HE染色,观察其病理特征;选取12例生长良好的模型用5-氟尿嘧啶和顺铂进行药效学实验;选取3例模型进行体外药物敏感性实验.结果 25例胃癌模型移植成功并能够稳定传代,成功率为25.52％.各代移植瘤组织形态学特征与患者肿瘤组织一致.体内药效学结果表明,5-氟尿嘧啶（25 mg/kg）对2例模型有一定的抑制作用（TGI＞60％）,对10例模型无明显的抑制作用.顺铂（5 mg/kg）对3例模型有明显的抑制作用（TGI＞100％）,对4例模型有一定的抑制作用（TGI,60％～90％）,对5例模型无明显抑制作用（TGI＜60％）.体外药物敏感性实验表明对5-氟尿嘧啶敏感程度依次为GAX001 （IC50：3.187 μm）＞GAX007（IC50：6.886 μmol）＞GAX027（IC50：8.323 μmol）,对顺铂敏感程度依次为GAX027（IC50：2.753 μmol）＞GAX001（IC50：3.211 μmol）＞ GAX007（IC50：8.137 μmol）.结论 成功建立了25例人源性胃癌小鼠移植瘤模型,移植瘤保留了临床胃癌的病理特征,对其中12例进行的药效学评价表明对相同的化疗药物敏感性不同,能够反映患者的遗传多样性,可用于抗肿瘤药物的筛选和研究.

人结肠癌原位移植瘤裸小鼠模型的活体成像观察

目的 建立人结肠癌原位移植瘤裸小鼠模型,探讨小动物活体成像系统在结肠癌原位移植瘤模型中的应用.方法 应用慢病毒转染的方法建立同时表达绿色荧光蛋白及荧光素酶（GFP/Luc）的人结肠癌细胞HCT-116,分别采用组织决法及培养细胞法建立裸小鼠结肠癌原位移植瘤模型,通过小动物活体成像系统动态观察肿瘤在肠原位的生长及转移情况.结果 成功建立了稳定表达GFP/Luc的人结肠癌细胞,并应用该细胞成功建立了结肠癌原位移植瘤动物模型.经连续7周动态观察表明,随着肿瘤移植时间的延长,腹部皮下触诊显示肿瘤逐渐增大,小动物活体成像显示荧光素表达面积和强度也逐渐增大.结论 小动物活体成像系统能够客观评价结肠癌的原位生长及转移情况,为体内深部肿瘤的观察和研究提供了有效的参考依据.

末治脾肾,能起沉疴———单纯中药治疗乙肝相关性肝癌1例

探讨中药审因论治对乙肝相关性肝癌的治疗作用。应用调补脾肾、搜邪泄浊法 ,对一例乙肝相关性肝癌患者进行单纯中药治疗。结果 :经过 12个月治疗 ,AFP由最高 10 0 0 0 μg/L降至正常 (<2 0 μg/L) ,AFP异质体同步转阴 ,B超、MRI显示肝部实质性肿块消散 ,肝功能好转。提示本治法对肝癌具有较好的治疗作用。

人肺腺癌干细胞的表型及其与肺腺癌患者预后的关系

目的检测肺腺癌组织中肿瘤干细胞的表型，并分析其与肺腺癌患者预后的相关性。方法采用免疫荧光法检测57例肺腺癌组织肿瘤干细胞的3个表型标志，即表面活性蛋白C（SP-C）、细支气管非纤毛柱状细胞标志蛋白（CCSP）和OCT4。采用Cox多因素分析，评估检测结果与临床病理指标及患者生存之间的关系。结果57例肺腺癌组织均表达SP-C，其中52例可观察到CCSP^＋细胞，具有肺细支气管肺泡干细胞（BASC）的表型特征。52例SP-C^＋CCSP^＋绀织中，40例同时表达OCT4，进入OCT4^＋BASC组；12例不表达OCT4，进入OCTd—BASC组。统计分析的结果显示，肺腺癌干细胞的表型与肺腺癌的分化相关，OCT4^＋BASC表型多见于高中分化肿瘤，而OCT4^-BASC表型以低分化肿瘤为主。Cox多因素分析的结果显示，肺腺癌患者的生存与肿瘤的TNM分期及OCT4^＋BASC表型相关。结论肺腺癌干细胞具有BASC的表型特征（SP—C^＋CCSP^＋），此类肿瘤干细胞表达自我更新基因OCTd时，恶性程度高，患者的预后差。

应用iTRAQ技术筛选高转移和低转移肺腺癌细胞中差异表达的膜蛋白

目的:筛选高转移和低转移肺腺癌细胞中差异表达的膜蛋白,以寻找肺癌的生物学标志物或治疗的潜在靶点。方法:提取具有相同来源、不同转移潜能的肺腺癌SPC-A-1和SPC-A-1sci细胞的膜蛋白,应用核素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术标记膜蛋白,联合纳升液相色谱和串联质谱(nanoliquid chromatography-tandem mass spectrometry,Nano-LC-MS/MS)分离、分析肽段,采用Proteinpilot 4.0软件对蛋白进行鉴定和定量分析,对获得的差异蛋白进行GO(Gene Ontology)分析,应用实时荧光定量-PCR和蛋白质印迹法进行验证。结果:样品进行4次NanoLC-MS/MS,鉴定出符合假阳性率<1%的分别有1413、1374、1297和1351个蛋白,标记率>95%,其中4次都上调的蛋白有27个(膜蛋白20个)、下调的蛋白有32个(膜蛋白25个)。GO分析显示,差异蛋白的分子功能主要集中在细胞骨架蛋白结合、同源蛋白结合和酶结合。生物学进程主要集中在代谢进程和细胞定位。SPC-A-1sci细胞中ITGA3(integrin alpha-3)、MYH9(myosin,heavy chain9)、PLEC1(plectin 1)、HADHA(3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase)、HK1(hexokinase-1)、KTN1(kinectin 1)、ESYT1(extended synaptotagmin-like protein 1)、ALDH18A1(aldehyde dehydrogenase 18 family,member A1)、ATP5A1(ATP synthase alpha-subunit)、LMNB2(lamin-B2)、CAV1(caveolin-1)和CK-19(keratin,typeI cytoskeletal19)mRNA的表达水平以及CLTC(clathrin,heavy chain)、HK1、LMNB2和CK-19蛋白的表达水平均高于SPC-A-1细胞,与质谱定量结果一致。结论:iTRAQ联合NanoLC-MS/MS技术能高通量地筛选与转移相关的膜蛋白,为肺腺癌患者转移的诊断和预后提供可能的生物学标志物或治疗靶点。

靶向TTF-1转录因子诱导人肺腺癌干细胞表型分化

肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSC)的典型特征是能够自我更新并分化形成肿瘤内各类癌细胞,但其分子调控机制还不清楚。本实验采用微纳米介导的小RNA(microRNA)基因沉默技术,探讨了选择性灭活甲状腺转录因子-1(thyroid transcription factor-1,TTF-1)对肺腺癌CSC分化的影响。结果显示,肺腺癌CSC属于具有胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)样表型的原始未分化细胞,此类癌细胞表达ESC自我更新核心调控环(OCT4、Nanog和Sox2)以及细支气管肺泡干细胞(bronchioalveolar stem cells)标志CCSP和SP-C、Ⅰ型肺泡细胞标志AQP5、纤毛细胞标志Foxj1和肺发育相关转录因子TTF-1及GATA6,而TTF-1灭活细胞仅表达SP-C和GATA6,此类细胞经培养后具有SP-C^-AQP5^+Ⅰ型肺泡细胞样表型。上述结果表明,TTF-1是维持肺腺癌CSC生物学特性的关键基因,靶向该基因将迫使其表型分化。

过表达CSRP1基因可促进人肺腺癌H1299细胞的增殖、迁移和侵袭

目的:探讨半胱氨酸和甘氨酸丰富蛋白1(cysteine and glycine rich protein 1,CSRP 1)基因过表达对人肺腺癌H1299细胞增殖、周期、迁移和侵袭的影响,及其可能的作用机制。方法:构建携带有CSRP 1基因的重组慢病毒质粒pCDH-CSRP1;将重组慢病毒Ad-CDH-CSRP1和pCDH-GFP(空载体对照组)分别感染人肺腺癌H1299细胞。实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测CSRP1 mRNA及蛋白在H1299细胞中的表达水平。CCK-8法和克隆形成实验检测CSRP 1基因过表达对H1299细胞增殖能力的影响;FCM法检测CSRP 1基因过表达对H1299细胞周期的影响。Transwell小室迁移实验和划痕愈合实验检测CSRP 1基因过表达对H1299细胞纵向和横向迁移能力的影响,Transwell小室侵袭实验检测对细胞侵袭能力的影响。蛋白质印迹法检测CSRP 1基因过表达对H1299细胞中黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)和磷酸化FAK(phospho-FAK,p-FAK)蛋白表达水平的影响。结果:重组慢病毒质粒pCDH-CSRP1构建成功。转入重组慢病毒质粒pCDH-CSRP1的H1299细胞中CSRP1蛋白的表达水平较pCDH-GFP组明显提高(P<0.01)。CSRP 1基因过表达可促进H1299细胞增殖(P<0.05),G1期细胞所占百分比明显下降(P<0.01),S期细胞所占百分比明显上升(P<0.01);CSRP 1基因过表达可明显增强H1299细胞的迁移和侵袭能力(P值均<0.01)。CSRP 1基因过表达的H1299细胞中p-FAK蛋白的表达水平明显升高(P<0.01),而总FAK蛋白的表达水平无明显变化(P>0.05)。结论:CSRP 1基因过表达可增强人肺腺癌H1299细胞的增殖、迁移和侵袭能力,其机制可能与FAK信号转导通路的激活有关。