3%巯基乙酸盐肉汤诱导法高效提取小鼠腹腔巨噬细胞

目的:比较不同方法提取小鼠腹腔巨噬细胞的生物学特性并筛选出高效的提取方法。方法:选取32只健康昆明小鼠,随机分为4组,每组8只,分别采用以下4种不同方法获得腹腔巨噬细胞:PBS直接灌洗小鼠腹腔(PBS组);含10%血清的RPMI 1640培养液注入小鼠腹腔,30 min后灌洗小鼠腹腔(培养液组); 6%淀粉肉汤注入小鼠腹腔,每天1次,3 d后以PBS灌洗腹腔(淀粉肉汤组); 3%巯基乙酸盐肉汤注入小鼠腹腔,每天1次,3 d后以PBS灌洗腹腔(巯基乙酸盐组);将各组所获细胞分别转入含10%血清的RPMI 1640培养基中贴壁培养,比较细胞形态、数量、吞噬能力、纯度以及活性。结果:4组巨噬细胞的形态无明显差异;与其他3组相比,巯基乙酸盐组诱导所得的细胞数量最多(t=16. 685,9. 361,3. 199,P均<0. 01),且吞噬能力最强(t=5. 675,3. 712,3. 026,P均<0. 01); 4组巨噬细胞的F4/80、CD68表达率以及活性均相似且高于95%,差异无统计学意义(F=0. 696,0. 647,0. 341,P均>0. 05)。结论:3%巯基乙酸盐肉汤诱导小鼠腹腔巨噬细胞后灌洗,是一种获取大量小鼠腹腔巨噬细胞的高效方法。

一种快速建立小鼠心肌缺血再灌注模型的方法

目的:探讨一种快速高效且不需要借助呼吸机和开胸操作的方法,建立小鼠心肌缺血再灌注模型。方法:取40只雄性昆明小鼠(6~8周龄,体重18~25 g),随机分为假手术组、缺血15 min+再灌注24 h组、缺血30 min+再灌注24 h组和缺血45 min+再灌注24 h组,每组10只。给予2%异氟烷气体麻醉,分离胸大肌和胸小肌,于左侧第3、4肋间隙挤出心脏,迅速定位,假手术组仅穿线不结扎,手术组分别结扎冠状动脉左前降支(LAD)15、30和45 min后,松开结扎线24 h以建立心肌缺血再灌注模型。同时在结扎前、结扎后5 min及再灌注24 h后进行心电图检测。再灌注24 h后在结扎部位再次进行结扎,进行伊文思蓝-TTC染色,垂直于心脏长轴切片,检测心肌缺血区和梗死区面积。结果:至再灌注24 h后,小鼠生存率为90%,心肌缺血再灌注造模成功率86. 7%。心电图检测显示LAD结扎5 min后均出现T波高耸,ST段抬高,QRS波增宽。随着再灌注时间延长,ST段逐渐回落。结扎LAD 5 min后,肉眼可见结扎线以下心室壁呈现灰白色,再灌注24 h后可见与周围组织区分明显的白色梗死区,心脏搏动频率和幅度较结扎前明显减弱。心肌组织切片经伊文思蓝-TTC染色呈现界限明显的缺血区、梗死区和正常心肌组织区。缺血45 min+再灌注24 h组小鼠(切片缺血区面积+梗死区面积)/左室总面积比值为(63. 8±6. 36)%,梗死区面积/(梗死区+缺血区面积)比值为(46. 7±5. 77)%。结论:该方法建立小鼠心肌缺血再灌注模型,减少了呼吸机使用所需要的时间,操作快速便捷,造模成功率大于85%。

CD137-CD137配体对巨噬细胞基质金属蛋白酶9及血管平滑肌细胞钙化形成的影响

目的探讨CD137-CD137配体(CD137L)信号是否通过调控巨噬细胞基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达影响血管平滑肌细胞(VSMC)钙化形成。方法采用巯基乙酸盐腹腔灌洗法获取C57BL/6J小鼠腹腔巨噬细胞(PM),采用组织块贴壁法取3~6代胸主动脉VSMC分为对照组、共培养组、CD137激动组和MMP-9抑制组(n=3)。对照组用重组CD137L蛋白干预VSMC,共培养组用PM和VSMC共培养,CD137激动组和MMP-9抑制组分别用重组CD137L蛋白和MMP-9抑制剂干预PM后,与VSMC共培养,再加入重组CD137蛋白(10μg/ml)干预。采用Western blot检测各组钙化相关的骨桥蛋白(OPN)、Runt相关转录因子2(Runx-2)表达,微板法检测钙离子浓度和碱性磷酸酶(ALP)活性,Von Kossa和茜素红染色检测各组细胞钙化程度。结果CD137激动组VSMC中OPN和Runx-2蛋白表达、钙离子浓度及ALP活性明显高于共培养组(P<0.01),而MMP-9抑制组VSMC中OPN和Runx-2蛋白表达、钙离子浓度及ALP活性明显低于CD137激动组,差异有统计学意义[0.25±0.27 vs 2.12±0.34,0.30±0.32 vs 2.63±0.41,(1.92±0.09)mmol/g vs(4.99±0.37)mmol/g,(1.11±0.50)KU/g vs(2.63±0.04)KU/g,P<0.01]。共培养组VSMC中OPN和Runx-2蛋白表达、钙离子浓度及ALP活性与对照组比较,无统计学意义(P>0.05)。CD137激动组茜素红染色红色颗粒物质沉积和Von Kossa染色黑色颗粒物质沉积明显多于对照组和共培养组;MMP-9抑制组钙化程度显著降低;对照组和共培养组钙化程度则无明显差异。结论CD137-CD137L信号可能通过调控巨噬细胞MMP-9表达影响VSMC钙化形成。

CD137信号调控巨噬细胞M1/M2极性转变促进血管新生

目的探讨CD137-CD137L信号(简称CD137信号)是否通过调控巨噬细胞M1/M2极性转变促进血管新生。方法将3%巯基乙酸盐肉汤诱导的小鼠腹腔原代巨噬细胞分3组,即对照组、CD137信号激动组和CD137信号抑制组,通过检测M1和M2型巨噬细胞的相关特异性标志物观察巨噬细胞表型的变化,采用流式细胞术(FCM)检测巨噬细胞表面CD137、CD86及CD206的表达,Western blot和RT-PCR检测巨噬细胞诱导性一氧化氮合酶(iNOS)、Ⅰ型精氨酸酶(Arg-1)的蛋白和mRNA表达。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测巨噬细胞培养上清中白细胞介素(IL)-12和IL-10分泌水平。将巨噬细胞和内皮细胞(bEnd.3)共培养,上室种植巨噬细胞,下室基质胶种植内皮细胞,实验分为3组,即对照组、CD137信号激动组和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)抑制组,检测各组内皮细胞的管腔形成能力。结果(1)分离的小鼠腹腔原代巨噬细胞纯度为(97.93±1.31)%,巨噬细胞表面CD137表达为(97.40±2.70)%。(2)与对照组比较,CD137信号激动组Arg-1 mRNA和蛋白表达水平较高(P<0.05),iNOS mRNA和蛋白表达水平较低(P<0.05);与CD137信号激动组比较,CD137信号抑制组Arg-1 mRNA和蛋白表达水平较低(P<0.05),iNOS mRNA和蛋白表达水平较高(P<0.05)。流式细胞术显示,CD137信号激动组CD206平均荧光强度高于对照组(P<0.05),而CD86平均荧光强度低于对照组(P<0.01);CD137信号抑制组CD206表达明显低于CD137信号激动组(P<0.05),CD86表达高于CD137信号激动组(P<0.01)。ELISA显示,CD137信号激动组IL-10分泌高于对照组(P<0.01),IL-12分泌明显低于对照组(P<0.01);而与CD137信号激动组比较,CD137信号抑制组IL-10分泌较低(P<0.05),IL-12分泌较高(P<0.05)。(3)内皮管腔形成实验显示,CD137信号激动组内皮细胞小管长度大于对照组,分支数量多于对照组(P<0.05);PPAR-γ抑制组的内皮细胞小管长度及分支数量的形成明显被抑制(P<0.05)。结论CD137信号可能通过调控巨噬细胞M1/M2极性转变促进血管新生。

CD137-CD137L信号通路通过Rab7分子调控自噬影响小鼠血管平滑肌细胞外泌体分泌

目的 探讨CD137-CD137配体(CD137L)信号通路是否通过Rab7分子调控自噬从而影响小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)外泌体的分泌.方法 采用组织块贴壁法原代培养C57BL/6J小鼠胸主动脉平滑肌细胞,取分离培养的第3~5代的VSMC进行实验.实验分为4组,即对照组、CD137激动组(采用10 μg/ml的CD137L重组蛋白激动CD137-CD137L信号通路)、慢病毒对照组(在CD137L重组蛋白干预的基础上加对照干扰慢病毒干预)和Rab7慢病毒干扰组(在CD137L重组蛋白干预的基础上加Rab7干扰慢病毒干预).Western blot法检测各组VSMC微管相关蛋白1轻链3(LC3Ⅱ)、p62和Rab7的蛋白表达.自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)荧光显微镜下观察各组VSMC自噬流的变化.透射电镜下观察VSMC来源外泌体的形态及大小,Western blot法检测外泌体标记物CD9、CD81和热激同源蛋白70(Hsc70)以及自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达,纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术检测各组VSMC分泌的外泌体的浓度.结果(1)各组VSMC中Rab7、LC3Ⅱ和P62的蛋白表达水平:CD137激动组VSMC中Rab7、LC3Ⅱ和p62蛋白表达水平均明显高于对照组(P均<0.05).Rab7慢病毒干扰组VSMC中Rab7、LC3Ⅱ和p62蛋白表达均低于CD137激动组(P均<0.05).慢病毒对照组VSMC中Rab7、LC3Ⅱ和p62蛋白表达与CD137激动组比较差异均无统计学意义(P均>0.05).(2)各组VSMC自噬流的变化:CD137激动组VSMC内荧光斑点总数和黄色荧光点数均多于对照组(P均<0.05),且CD137激动组VSMC内黄色荧光点数多于红色[分别为(50.3±0.9)和(10.3±1.5)个/细胞].而Rab7慢病毒干扰组VSMC内荧光斑点总数和黄色荧光点数均少于CD137激动组(P均<0.05),且Rab7慢病毒干扰组VSMC内红色荧光斑点数多于黄色[分别为(40.7±4.0)和(10.7±1.2)个/细胞].慢病毒对照组VSMC内荧光斑点总数和黄色荧光点数与CD137激动组比较差异均无统计学意义(P均>0.05).(3)小鼠VSMC来源的外泌体的鉴定、外泌体标记物CD9、CD81的表达以及各组VSMC外泌体浓度和自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达:透射电子显微镜下观察,分离和纯化的小鼠VSMC分泌的外泌体为直径30~150 nm的囊泡状结构.Western blot结果显示,在纯化的外泌体中检测到外泌体标记物CD9、CD81蛋白的高表达.NTA技术检测结果示,CD137激动组VSMC外泌体浓度明显高于对照组(P<0.05);Rab7慢病毒干扰组VSMC外泌体浓度明显低于CD137激动组(P<0.05);慢病毒对照组VSMC外泌体浓度与CD137激动组比较差异无统计学意义(P>0.05).CD137激动组VSMC外泌体中Hsc70蛋白表达高于对照组(P<0.05);Rab7慢病毒干扰组VSMC外泌体中Hsc70蛋白表达低于CD137激动组(P<0.05);慢病毒对照组VSMC外泌体中Hsc70蛋白表达水平与CD137激动组比较差异无统计学意义(P>0.05).CD137激动组VSMC外泌体中LC3Ⅱ的表达水平高于对照组(P<0.05),Rab7慢病毒干扰组低于CD137激动组(P<0.05),慢病毒对照组与CD137激动组比较差异则无统计学意义(P>0.05).结论 CD137-CD137L信号通路可能通过Rab7分子调控自噬进而影响小鼠血管平滑肌细胞外泌体的分泌.