盐酸胍对人类胎盘碱性磷酸酶构象与活力的影响

研究人类胎盘碱性磷酸酶（ＰＬＡＰ，Ｅ．Ｃ．３．１．３．１）在胍变性过程中构象与活力的变化；测定胍存在时酶的表观米氏常数（Ｋｍ）。结果表明，低浓度的盐酸胍（＜０．５ｍｏｌ／Ｌ）使变性平衡态酶的发射荧光强度略有下降，酶活力增强；随盐酸胍浓度的增加，其荧光强度不仅不再下降，反而升高，酶逐渐失活；当盐酸胍浓度为１．５ｍｏｌ／Ｌ时，其荧光光谱的最大峰位红移，酶活力迅速下降；当盐酸胍浓度为３ｍｏｌ／Ｌ时，峰位由３３３．５ｎｍ红移至３５７．１ｎｍ，此时酶活力丧失；当盐酸胍浓度为４ｍｏｌ／Ｌ时，峰位不再红移，但其荧光强度继续增加。测得变性初态酶的表观Ｋｍ值随盐酸胍浓度的增加而增大。结果说明，荧光强度的增加和最大发射峰位的红移是该酶变性失活的一个灵敏指标；酶活力的变化明显快于酶分子整体构象的变化；低浓度的盐酸胍微扰了酶活性部位的构象，而对其整体构象无显著影响。提示酶活性部位具有柔性。

五氯酚对人胎盘碱性磷酸酶抑制的研究

监测人胎盘碱性磷酸酶在不同浓度五氯酚溶液中活力与荧光光谱的变化 ;测定五氯酚对其抑制的类型及pH对其抑制的影响 .结果显示 :低浓度的五氯酚 (<1 0mmol/L)使酶活力及其荧光强度迅速下降 ,发射峰位明显红移 ;继续提高五氯酚浓度 ,其活力与荧光强度逐渐下降 ,发射峰位仍在红移 ;五氯酚浓度为 5 0mmol/L时 ,荧光淬灭 ,但酶仍保留 5 1 4%的活力 ;五氯酚浓度高达 10 0mmol/L时 ,酶剩余活力为 30 0 % .进一步实验表明五氯酚使L 色氨酸的荧光强度降低 ,并伴有发射峰位的红移 ,当五氯酚浓度为 5 0mmol/L时 ,L 色氨酸的荧光淬灭 .五氯酚是人胎盘碱性磷酸酶的反竞争性抑制剂 ,其抑制常数 (Ki)为 3 86mmol/L .其抑制也受溶液 pH影响 ,pH <7 5时 ,对酶无抑制 ;pH为 7 5～ 10 5时 ,随 pH的增加 ,抑制作用逐渐增强 .提示五氯酚能够进入酶分子内部使其荧光淬灭 ,并抑制了酶活力 ;表明酶活力抑制与五氯酚的解离状态有关 .

五氯酚对人胎盘碱性磷酸酶构象与活力的影响

目的；研究三氯酚对人胎盘碱性磷酸酶构象与活力的影响。材料和方法：应用荧光光度法检测不同浓度五氯酚溶液中人胎盘碱性磷酸酶的内源荧光发射光谱，用分光光度法测定其活力。结果：五氯酚浓度小于1．0mmol／L时,平衡态酶的内源荧光发射强度及其活力迅速下降，发射峰位明显红移；继续提高五氨酸浓度，其荧光发射强度与活力逐渐下降，发射峰位仍在缓慢红移；五氯酚浓度增至5．0mmol／L时，荧光淬灭，但酶仍保密51．4％的活力。结论：五氯酚抑制了酶活力，并使其构承发生了改变，但其整体构象并未破坏。

人类胎盘碱性磷酸酶的分离纯化

①目的分离纯化人类胎盘碱性磷酸酶（ＰＬＡＰ）。②方法应用正丁醇抽提、丙酮沉淀、热处理、ＤＥＡＥ－纤维素和ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０柱层析，从人类胎盘中提纯ＰＬＡＰ；聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）和高压液相层析（ＨＰＬＣ）鉴定其纯度；十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳测其亚基分子量。③结果ＰＬＡＰ的纯化倍数为１６１倍，比活力为１３８ｍｍｏｌ·ｓ－１／ｇ；纯化的ＰＬＡＰ经ＰＡＧＥ鉴定为单一区带，ＨＰＬＣ分析为单一对称峰；测得酶的亚基分子量为６４．６９ｋｕ．④结论纯化的ＰＬＡＰ已达电泳纯和层析纯。

人类胎盘碱性磷酸酶在脲变性时构象与活力的变化

目的：研究脲对人胎盘碱性磷酸酶构象与活力的影响。方法：用分光法测定不同浓度脲溶液中的紫外差光谱及活力；荧光法测其荧光光谱。结果：低浓度脲（＜2．0 mol／L），酶的差光谱在262 nm出现负峰；荧光强度下降，发射峰位蓝移；脲浓度为0．5 mol／L时，酶活力仍维持在原有水平，此后随脲浓度增加，酶活力下降。继续提高脲浓度，差光谱在276 nm出现正峰；荧光强度回升，发射峰位红移；酶活力迅速下降。当脲浓度高达8．0 mol／L时，差光谱在262 nm又出现负峰；荧光强度继续增强，发射峰位还在红移；酶仍有部分活力。结论：酶活力变化慢于其构象变化，但酶活性部位较整个分子而言更易受到脲的扰乱。

铅对人类胎盘碱性磷酸酶活力与构象的影响

目的研究铅对人类胎盘碱性磷酸酶（ＰＬＡＰ）的作用，以探讨铅影响胎儿发育的分子机制。②方法应用分光光度法测定不同浓度Ｐｂ（ＮＯ３）２存在下的ＰＬＡＰ活力，用荧光法检测其荧光光谱的变化；用双倒数作图法确定Ｐｂ（ＮＯ３）２对该酶的抑制类型。③结果低浓度的Ｐｂ（ＮＯ３）２（＜０．５０ｍｍｏｌ／Ｌ）对酶活力无明显影响，但其内源荧光强度略有增加，发射峰位蓝移；当Ｐｂ（ＮＯ３）２的浓度为０．７５ｍｍｏｌ／Ｌ时，酶活力及其荧光强度均迅速下降；当Ｐｂ（ＮＯ３）２浓度＞０．７５ｍｍｏｌ／Ｌ时，随其浓度的增加，酶活力与其荧光强度逐渐降低，但发射峰位蓝移减少；当Ｐｂ（ＮＯ３）２浓度为１０．００ｍｍｏｌ／Ｌ时，酶活力丧失，荧光熄灭。Ｐｂ（ＮＯ３）２是ＰＬＡＰ的反竞争性抑制剂，其抑制常数为１．４０ｍｍｏｌ／Ｌ．④结论Ｐｂ（ＮＯ３）２抑制了ＰＬＡＰ的活力，并使其构象发生了改变，这可能是铅影响胎儿发育的重要分子机制之一。

L-亮氨酸对人类胎盘碱性磷酸酶的抑制

①目的确定Ｌ－亮氨酸（Ｌ－Ｌｅｕ）对人类胎盘碱性磷酸酶（ＰＬＡＰ）的抑制类型，并探讨其抑制机理。②方法应用分光光度法分别测定有Ｌ－Ｌｅｕ和无Ｌ－Ｌｅｕ存在下的酶活力，根据其活力变化求出酶的相对活力；用双倒数作图法，确定Ｌ－Ｌｅｕ对ＰＬＡＰ的抑制类型并求出其抑制常数（Ｋｉ）；同时也观察了ｐＨ对抑制作用的影响。③结果Ｌ－Ｌｅｕ对ＰＬＡＰ有明显地抑制作用，抑制程度与ｐＨ有关；双倒数作图得到一组平行线，Ｋｉ为１．９８ｍｍｏｌ／Ｌ．④结论Ｌ－Ｌｅｕ是ＰＬＡＰ的反竞争性抑制剂。

汞对人类胎盘碱性磷酸酶活力与荧光光谱的影响

目的研究汞对人类胎盘碱性磷酸酶（ＰＬＡＰ）活力及其荧光光谱的影响，以探讨汞对ＰＬＡＰ抑制的分子机制。②方法应用分光光度法测定不同浓度ＨｇＣｌ２存在下的酶活力，用荧光法检测其荧光光谱；用双倒数作图法确定ＨｇＣｌ２对该酶的抑制类型。③结果当ＨｇＣｌ２浓度为０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ时，酶活力及其荧光强度迅速下降，最大发射峰位由３４７ｎｍ蓝移至３４０ｎｍ；ＨｇＣｌ２浓度为０．２５～１．００ｍｍｏｌ／Ｌ时，酶活力、荧光强度及峰位均无显著变化；当ＨｇＣｌ２浓度＞１．００ｍｍｏｌ／Ｌ时，随其浓度增加，酶活力和荧光强度又快速下降，但峰位不变；ＨｇＣｌ２浓度高达１０．００ｍｍｏｌ／Ｌ时，酶仍有部分活力。ＨｇＣｌ２是ＰＬＡＰ混合性抑制剂，其抑制常数为３．６０ｍｍｏｌ／Ｌ．④结论ＨｇＣｌ２抑制了ＰＬＡＰ的活力，并使其构象发生了改变。

人类胎盘碱性磷酸酶在胍和脲变性时的活力变化

①目的探讨人类胎盘碱性磷酸酶（ＰＡＬＰ）在胍和脲变性时的活力变化，为研究ＰＡＬＰ的分子进化及其作用机制、构象与活力的关系奠定基础。②方法在不同浓度的盐酸胍或脲的存在下，按标准方法测定ＰＡＬＰ在变性终态和变性过程中的活力变化。③结果ＰＡＬＰ在胍变性过程中，盐酸胍浓度在２．０ｍｏｌ／Ｌ之内其活力增加，大于２．０ｍｏｌ／Ｌ时活力降低，５．０ｍｏｌ／Ｌ以上活力丧失；ＰＡＬＰ在胍变性终态时，不同浓度的盐酸胍均抑制其活力。ＰＡＬＰ在脲变性过程中或变性终态时其活力均降低。④结论提示ＰＡＬＰ与其他不同来源的碱性磷酸酶起源相同。

人类胎盘碱性磷酸酶部分性质的研究

目的探讨纯化的人类胎盘碱性磷酸酶（ＰＬＡＰ）的部分性质，为其结构与功能的研究积累资料。②方法应用分光光度法观察了温度、酸碱度及抑制剂对酶活力的影响；同时对其紫外吸收光谱进行了测定。③结果在该实验条件下，酶的最适温度为６５℃，对热稳定，－２５℃冷冻后酶的活力明显下降；最适ｐＨ为１１．０，在ｐＨ７．０～１１．５之间稳定；以对硝基酚磷酸二钠为底物，其Ｋｍ值为０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ；Ｌ－苯丙氨酸是ＰＬＡＰ的反竞争性抑制剂，其抑制常数为２．３５ｍｍｏｌ／Ｌ，而ＮａＨ２ＰＯ４是ＰＬＡＰ的竞争性抑制剂，其抑制常数为０．９９ｍｍｏｌ／Ｌ；酶蛋白的最大紫外吸收波长为２８０ｎｍ．④结论了解纯化ＰＬＡＰ的上述性质，有助于其结构与功能的研究。

胍对人胎盘碱性磷酸酶内源荧光的影响

：目的：研究盐酸胍对人胎盘碱性磷酸酶内源荧光光谱的影响。方法：用荧光光度计检测了不同浓度盐酸胍溶液中人胎盘碱性磷酸酶内源荧光发射光谱。结果：盐酸胍小于１．０ｍｏｌ／Ｌ时，平衡态酶内源荧光发射强度减小，随胍浓度增大，荧光发射强度增大，且当胍浓度大于１．０ｍｏｌ／Ｌ时，其荧光光谱的最大发射峰位出现明显红移，至胍浓度为４．０ｍｏｌ／Ｌ时红移停止。结论：低浓度胍仅微扰了酶活性部位的构象，而高浓度胍改变了酶的整体构象。

酮体生成和利用定量实验方法的建立

以丁酸钠为作用物,利用组织切片培养法,建立了定量测定酮体生成和利用的实验方法。实验的最适条件是:大鼠饥饿48小时;气温10～20℃,以15℃为宜;丁酸钠浓度0.75mol/L;37℃恒温振荡培养时间4小时。依此,可定量测定肝脏生成或其它组织利用的酮体量。

葡萄球菌核酸酶去C-末端的肽段52和79的分离纯化

①目的建立金黄色葡萄球菌核酸酶（ＳＮａｓｅ）去Ｃ－末端的肽段５２（ＳＮ５２）和７９（ＳＮ７９）的提纯方法，并鉴定其纯度。②方法应用低温乙醇沉淀，ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０和ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－１００柱层析分离纯化；十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）和高效液相层析（ＨＰＬＣ）鉴定其纯度。③结果纯化的ＳＮ５２和ＳＮ７９经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定均为单一区带；ＨＰＬＣ鉴定均为一个峰。④结论纯化的ＳＮ５２和ＳＮ７９已达电泳纯和层析纯，可用于其构象的比较研究。

五氯酚对人类胎盘碱性磷酸酶的抑制

①目的 探讨五氯酚(PCP)对人类胎盘碱性磷酸酶(PLAP)的作用,为PCP中毒的防治提供理论依据。②方法 应用比色法分别测定有PCP和无PCP存在下PLAP的酶活力,根据其活力变化求出酶的相对活力;用双倒数作图法,确定PCP对PLAP的抑制类型并求其抑制常数(K_1)。③结果PCP的存在抑制了酶活力。当PCP的浓度在6mmol/L之内,随其浓度的增加而酶活力逐渐降低;当PCP的浓度为6mmol/L时,酶的相对活力为52.4%．PCP是PLAP的非竞争性抑制剂,其K_1为3.49mmol/L.④结论PCP对PLAP有抑制作。

血酮体定量及其临床应用

建立了一种血酮体定量方法。测定的最适条件是,硫酸浓度为9mol/L;高锰酸钾浓度为5%(170mmol/L);沸水浴加热时间20min;比色波长420nm。应用本法测定了25例正常人和60例糖尿病人血酮体量。糖尿病人血酮体量明显升高(P<0.001),Ⅰ型与Ⅱ型糖尿病人血中酮体量亦有显著的差别(P<0.001)。血酮体的定量测定有助于临床糖尿病的分型。

间苯三酚分光光度法测定硫酸软骨素的研究

目的 :建立一种快速准确的硫酸软骨素测定方法。方法 :利用含有间苯三酚的无机酸与样品中硫酸软骨素反应生成有色产物进行分光光度分析。结果 :10 0℃反应 30min在波长 5 5 8nm处测定硫酸软骨素 ,在 0 .10～ 1.0mg/ml范围内线性关系良好 (r =0 .9993) ,具有较好重现性。 结论 :此法操作简便、结果准确。

VEGF基因表达抑制对胃腺癌细胞SGC-7901增殖的影响

目的:研究siRNA(small interfering RNA)对人胃腺癌细胞SGC-7901的VEGF基因表达的影响．方法:选择血管内皮生长因子(VEGF)基因为靶基因,设计两组针对VEGF mRNA的小干扰RNA,合成DNA寡核苷酸链,体外转录合成siRNA．以人胃腺癌细胞系SGC-7901为靶细胞,应用脂质体转染的方法,将siRNA导入细胞．采用Hoechst33258染色观察siRNA作用于SGC-7901细胞中出现凋亡小体的情况．流式细胞仪检测细胞周期的改变,RT-PCR法比较转染前后VEGF mRNA表达水平的变化, ELISA法检测细胞培养液中VEGF蛋白分泌量的变化．结果:两组siRNA转染后均能有效地抑制 SGC-7901细胞的生长,诱导细胞凋亡产生凋亡小体．siRNA作用于SGC-7901细胞．其细胞周期均发生了明显的变化,主要表现为G0／G1 期细胞增多,S期细胞减少,并使细胞周期阻滞于G0／G1期(siRNA1组,siRNA2组G0／G1期VS 对照组G0／G1期:75．04％,76．52％ vs 58．37％, P<0．01;siRNA1组,siRNA2组S期vs对照组S 期:17．82％,16．73％ vs 39．52％,P<0．01),而其他组则无明显变化．VEGF mRNA的表达量大幅度减少(siRNA1组,siRNA2组vs对照组: 0．638±0．078,0．656±0．085 vs 0．941±0．046, P<0．01),相对应的VEGF蛋白水平也显著降低(164．7±22．7,166．3±26．6 vs 414．0±61．5, P<0．01),而其他组siRNA转染后则无上述作用．结论:应用靶向VEGF基因RNA干扰技术可以有效抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖．

猪软骨中硫酸软骨素的分离纯化

目的从猪鼻软骨中提纯硫酸软骨素。方法猪软骨经稀碱 酶解法提取 ,SephadexG 1 0凝胶过滤法、D0 6 1离子交换色谱法纯化。结果提纯的硫酸软骨素经电泳、色谱检查不含蛋白质、肽类、氨基酸及其他酸性黏多糖 ,经红外光谱检查与Sigma公司硫酸软骨素A一致 ,经高效液相离子色谱鉴定纯度已达 99.7%。

fat-1基因对乳腺癌细胞的增殖抑制作用

目的:研究fat—1基因在人乳腺癌细胞内的表达、功能及其对乳腺癌细胞增殖的影响。方法:把fat-1基因插入到腺病毒的穿梭载体中,与骨架载体同源重组,构建腺病毒重组载体(Ad.GFP.fatl),将通过包装细胞系(293)产生的腺病毒感染人乳腺癌株QMB2细胞。提取细胞的总RNA,以fat-1的反义mRNA作探针,用NorthernBlot检测fat-1基因在人乳腺癌株QMR2细胞内的表达。流式细胞仪分析n-3脂肪酸脱氢酶对人乳腺癌株QMB2细胞增殖的影响。气象色谱仪分析n-3脂肪酸脱氢酶对人乳腺癌株QMR2细胞的n-6PUFAs/n-3PUFAs含量影响。结果:fat-1基因在人乳腺癌株QMR2细胞中能有效异源表达,2d后检测到fat-1mRNA的条带。fat-1基因抑制了人乳腺癌株QMB2细胞的增殖,降低了20%(P<0.05);同时降低了人乳腺癌株QMR2细胞n-6PUFAs/n-3PUFAs含量降低。结论:腺病毒介导的fat-1基因能在人乳腺癌株QMR2细胞内有效异源表达,且抑制人乳腺癌株QMR2细胞的增殖。

ω-6脂肪酸脱氢酶基因在乳腺癌细胞内的表达和作用

为探讨ω- 6脂肪酸脱氢酶基因fat -1在人类乳腺癌细胞MCF- 7中表达和对其生长的作用,将fat -1基因插入到腺病毒载体中,构建腺病毒重组载体(Ad·GFP·fat1) .通过包装细胞系(2 93)产生重组腺病毒,感染MCF 7细胞.用核糖核酸酶保护性分析技术,检测fat -1基因在MCF- 7细胞内的表达,细胞增殖试剂盒(MTT)和凋亡染色试剂盒染色分析fat 1基因对MCF- 7细胞增殖和凋亡的影响,用酶联免疫分析花生酸类(eicosanoids)前列腺素E2 (prostaglandinE2 )的含量.结果显示,腺病毒介导的fat- 1基因能在MCF- 7细胞内有效异源表达,抑制MCF -7细胞的增殖且导致凋亡,前列腺素的含量也明显地减少.结果说明,fat- 1基因在乳腺癌的基因治疗中具有良好利用价值.