脱细胞脂肪组织制备：能否成为异体注射或原位成脂的软组织填充物

背景:通过脱细胞脂肪组织构建无种子细胞的组织工程脂肪为当前软组织填充的研究热点。目的:探讨近年来脱细胞脂肪组织的制备方法对其移植后诱导脂肪再生效果的影响,并展望其临床应用前景。方法:检索1971年1月至2018年12月PubMed数据、Elsevier数据库相关文献,英文检索词为“adipose tissue engineering;adipose tissue extracellular matrix;soft tissue repair;angiogenesis;adipogenic induction”。阅读近年国内外与脱细胞脂肪组织制备和移植相关的文献,从脱细胞脂肪组织制备方法的改良,交联细胞因子和生物材料等方面进行总结归纳。结果与结论:当前研究表明,脂肪组织细胞外基质可作为软组织填充的理想支架材料,植入皮下可募集宿主干细胞并诱导期增殖和成脂分化。但现有的脱细胞方案会导致细胞外基质蛋白和结构的损失,这极大的影响了脱细胞脂肪组织植入体内的脂肪再生能力,但通过超临界二氧化碳设备脱油、机械力预处理、交联细胞因子或生物材料等手段可以减少脱细胞脂肪组织制备过程中细胞外基质蛋白的损失和或补充具有促进组织再生功能的蛋白,最终提高脱细胞脂肪组织移植后的血管和脂肪新生能力。脱细胞脂肪组织由于其天然的成脂诱导能力,在脂肪组织工程中具有强大的应用前景,若能克服其制备流程中细胞外基质蛋白损耗或在安全可控的前提下,有望成为可异体注射并原位成脂的理想软组织填充物。

Streptococcus thermophilus IMAU20551胞外多糖基因簇及其表达分析

以1株产胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)IMAU20551为研究对象,提取其DNA后采用Illumina HiSeq技术对DNA进行二代基因组重测序,并利用SOAPdenovo软件对其进行组装,通过与RAST、直系同源集、基因本体论、京都基因与基因组百科全书等数据库进行比对,注释基因组中功能基因。发现S.thermophilus IMAU20551基因组全长1725107 bp,共注释出1884个功能基因,其中包含一个长度为19376 bp的完整eps基因簇,该基因簇中与EPS合成相关的基因共有18个,主要包括epsA、epsB、epsC、epsD、epsE、eps1F、eps2F、epsJ、wzx、epsP和epsX等,这些基因分别对EPS的合成、组装以及转运输出进行调控。另一方面,利用实时聚合酶链式反应对S.thermophilus IMAU20551 eps基因簇表达进行验证,发现所有基因均可表达,且除个别糖基转移酶基因外,其他被测基因均在6 h达到最大表达量。本研究介绍了S.thermophilus IMAU20551的基因组特征、eps基因簇及其表达能力,为今后深入研究S.thermophilus EPS基因簇及其表征结构的互作关系奠定基础。

中药体外抗幽门螺杆菌试验方法研究

目的探讨简便适用的中药体外抗幽门螺杆菌(Hp)试验的定性、定量方法。方法制备Hp选择琼脂平板,将中药药液倍比稀释后,制备含不同药物浓度的Hp选择琼脂平板,产气袋法培养Hp。先用打孔法定性测定中药制剂对Hp的抑菌作用,再用固体培养基连续稀释法和滴注法定量测定中药制剂对Hp的MBC。结果用4×105CFU/ml浓度菌液,1︰16稀释的试验药打孔法可测出抗Hp的抑菌圈;固体培养基连续稀释法和滴注法测得试验药对Hp的MBC为1︰40。结论利用打孔法、固体培养基连续稀释法和滴注法可测定中药制剂体外抗Hp效果。

幽门螺杆菌感应蛋白CrdS的原核表达及生物信息学分析

目的原核表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感应蛋白CrdS,并对其进行生物信息学分析,以探讨其酸适应的调控机制。方法从H.pylori 26695标准株全基因组DNA中PCR扩增编码CrdS蛋白的基因hp1364,插入原核表达载体pQE30,构建重组表达质粒pQE30-hp1364,转化大肠埃希菌(E.coli)XL1-blue,IPTG诱导表达重组CrdS蛋白。表达的重组蛋白经Western blot鉴定后,进行生物信息学分析。结果重组表达质粒pQE30-hp1364经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为46 000,表达量占菌体总蛋白的30%,主要以包涵体形式存在,可与Rabbit anti His-Tag Polyclonal Antibody特异性结合;生物信息学分析显示,CrdS的核苷酸序列和氨基酸序列与其他H.pylori菌株(HpG27、F30、B38)具有高度同源性,表面有许多亲水性区域,含多种易被磷酸化的氨基酸。结论成功原核表达了H.pylori CrdS蛋白,并进行了生物信息学分析,为进一步探讨CrdS的感应机制及通过阻断信号感应抗H.pylori感染的途径提供了实验材料。

幽门螺杆菌CrdS蛋白的原核表达和初步鉴定

原核表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)酸适应感应蛋白CrdS,探讨其酸适应的调控机制。提取H.pylori26695标准株全基因组DNA作为模版,PCR扩增编码CrdS蛋白的基因hp1364,构建重组克隆质粒pUCm-T-hp1364和原核表达质粒pQE30-hp1364,经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,转化大肠埃希菌XL1blue,IPTG诱导表达CrdS蛋白。结果表明:通过Western blot鉴定和SDS-PAGE分析该重组蛋白的相对分子质量约为46kDa,主要以包涵体形式存在。原核表达并成功获得的H.pylori CrdS蛋白,能够为探讨其酸适应的调控机制和新的抗H.pylori感染的途径提供实验材料。

固相微萃取-气相色谱-质谱结合电子鼻技术分析发酵乳中挥发性风味物质

【背景】德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)作为酸奶的常用发酵剂,在乳制品生产中的应用十分广泛。【目的】在前期研究基础上,以筛选出的具有良好风味的复配发酵剂(复配比为1:100)L.delbrueckii subsp.bulgaricus IMAU20312与S.thermophilus IMAU80809为实验对象,分析牛乳在发酵及贮藏期间风味物质的动态变化规律,为发酵剂的开发与应用提供依据。【方法】采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用(solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS)结合电子鼻技术检测并解析新鲜牛乳在发酵及贮藏阶段所产生的挥发性风味物质。【结果】该发酵剂在牛乳发酵及贮藏期间产生酸类物质23种,醛类物质13种,醇类物质15种,酮类物质18种,酯类物质11种,烷烃类物质22种。香气活度值(odor activity value,OAV)结果表明发酵乳中关键性风味物质(OAV≥1)有2种,而其他化合物如1-辛烯-3-醇、3-羟基丁醛、3-甲基-正丁醛、2,3-丁二酮、2-壬酮及己酸乙酯等对发酵乳的整体风味起修饰作用(0.1≤OAV<1)。热图聚类分析的结果表明牛乳在发酵与贮藏期间产生的风味物质有显著差异,类似的分析结果在电子鼻系统检测分析中也有发现。【结论】该复配发酵剂在牛乳发酵和贮藏期间能产生的多种风味物质,这些化合物能赋予产品良好的风味。

嗜热链球菌IMAU20246胞外多糖基因簇及其表达分析

【目的】嗜热链球菌IMAU20246是一株具有良好发酵特性且高产胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)的菌株,但其EPS基因簇及合成途径尚不清晰。因此可通过全基因组测序及生物信息学分析菌株基因组序列,探究EPS合成及调控机制。【方法】本实验对嗜热链球菌IMAU20246进行全基因组测序并进行生物信息学分析,解析EPS生物合成相关基因簇及EPS合成途径,同时采用实时荧光定量PCR技术(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)对其不同时间点EPS基因簇的表达进行定量分析。【结果】嗜热链球菌IMAU20246基因组中有一个18.1 kb的EPS生物合成基因簇,编码15个与EPS生物合成相关的基因。嗜热链球菌IMAU20246通过转运葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、乳糖、海藻糖、纤维二糖及蔗糖合成UDP-葡萄糖、dTDP-葡萄糖、dTDP-鼠李糖、UDP-半乳糖、UDP-呋喃半乳糖、UDP-N-乙酰葡萄糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺等7种糖核苷酸。qRT-PCR的结果表明,EPS基因簇中的基因在细胞生长阶段均能表达,特别是糖基转移酶基因epsE、epsF、epsH和epsJ在培养6 h时表达量最高,此时EPS产量达到最高。【结论】本研究从基因组解析了嗜热链球菌IMAU20246 EPS基因簇及其合成途径,为菌株的进一步开发提供了理论依据。

幽门螺杆菌CrdR蛋白的原核表达

目的原核表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)CrdR蛋白(即HP1365),以探讨其在酸适应中的调控机制。方法从H.pylori 26695标准株基因组DNA中PCR扩增hp1365基因,克隆至表达载体pGEX-6P-1中,转化E.coli JM109,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果重组表达质粒pGEX-hp1365经双酶切、PCR和测序鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为25 000,主要以包涵体形式表达,可与鼠抗His标签单克隆抗体特异性结合。结论原核表达了H.pylori CrdR蛋白,为进一步探讨其对酸信号的感应机制及其通过阻断酸信号的感应抗H.pylori感染的途径奠定物质基础。

脂肪来源干细胞胞外囊泡调控转化生长因子β-Smad信号通路抑制瘢痕增生的分子机制研究

目的探讨脂肪干细胞-细胞外囊泡(ASC-EVs)对肌成纤维细胞转分化过程中转化生长因子β(TGF-β)-Smad信号通路的调控作用。方法脂肪干细胞来源于南昌大学第二附属医院整形美容科行吸脂术患者的抽吸脂肪。真皮成纤维细胞来源于同一科室包皮环切术患者自愿捐赠的皮肤组织。将脂肪抽吸物离心纯化后经酶消化提取脂肪来源于细胞(ASCs),扩增后行流式细胞术检测表面蛋白标记物。收集第3~5代ASCs上清液提取胞外囊泡(EVs),透射电镜观察微观形态,纳米颗粒跟踪分析仪NanoSight检测粒径分布,流式细胞术检测其膜表面标志性蛋白CD63、Alix和TSG101。用PKH67荧光标记的ASC-EVs与真皮成纤维细胞共培养后,共聚焦显微镜观察细胞对EVs的摄取情况。通过TGF-β1持续诱导真皮成纤维细胞5 d,并添加50、100μg/ml浓度的ASC-EVs,通过免疫荧光染色,RT-PCR和蛋白质印迹法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及Smad-2/3/4的表达。结果流式细胞术结果提示,第3代ASCs表面标记物CD73、CD49d、CD90、CD105为阳性,CD34、CD45为阴性。透射电镜下ASC-EVs为圆形膜性囊泡,边缘清晰,由双层磷脂膜包裹。95%以上的ASC-EVs粒径为(30.0~261.0)nm,平均(166.0±86.1)nm。EVs高表达标志蛋白CD63、Alix和TSG101。共聚焦显微镜下可见携带绿色荧光的ASC-EVs被真皮成纤维细胞摄取并分布在胞浆内,部分ASC-EVs在细胞核周围分布。α-SMA免疫荧光染色后,经连续5 d的TGF-β1诱导,共聚焦显微镜下见真皮成纤维细胞中α-SMA绿色荧光的表达显著提高,而采用50μg/ml和100μg/ml ASC-EVs作用的真皮成纤维细胞中,α-SMA的表达较未经ASC-EVs作用的真皮成纤维细胞显著降低,但不呈现浓度依赖;细胞α-SMA和Smad-2/3/4的mRNA转录水平较未经ASC-EVs作用的真皮成纤维细胞显著下降,α-SMA和Smad-2/3/4的蛋白表达也显著降低。此外,ASC-EVs可显著降低细胞分泌至上清液中的Ⅰ型胶原的含量,但对Ⅲ型胶原的分泌量无明显干预作用。结论ASC-EVs抑制瘢痕增生的作用机制可能与抑制真皮成纤维细胞中TGF-β-Smad信号通路,干扰肌成纤维细胞转分化,减少Ⅰ型胶原分泌密切相关。

人脂肪源细胞外囊泡联合脱细胞脂肪组织支架构建组织工程脂肪

目的探讨人脂肪源细胞外囊泡(human adipose tissue derived extracellular vesicle,hAT-EV)联合脱细胞脂肪组织支架(decellularized adipose tissues,DAT)构建组织工程脂肪的可能性,为临床上软组织缺损修复提供新方案。方法将吸脂手术患者自愿捐赠的脂肪组织分为2份,1份脂肪组织进行脱细胞处理,并采用组织学(HE、Masson染色)、扫描电镜观察,Ⅰ、Ⅳ型胶原及层粘连蛋白免疫组织化学染色和Western blot检测进行表征。另1份脂肪组织使用去外泌体的完全培养基孵化48 h,离心收集培养基上清并使用超高速离心法获取hATEV。使用透射电镜观察其形态,纳米颗粒跟踪分析仪NanoSight分析hAT-EV粒径分布范围,Western blot检测分析hAT-EV膜表面蛋白。将PKH26荧光标记的hAT-EV与脂肪干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)共培养后,共聚焦荧光显微镜观察hAT-EV能否进入ADSCs;将hAT-EV与ADSCs共培养15 d,油红O染色评估其成脂效果。将DAT组织剪碎并注射至8只6周龄雌性C57小鼠背部两侧,左侧每周注射0.2 mL hAT-EV作为实验组,右侧每周注射0.2 mL PBS作为对照组。12周后处死小鼠,取两侧DAT新生物进行湿重称量,并通过HE染色和围脂滴蛋白免疫荧光染色评估hAT-EV在体内诱导脂肪新生的能力。结果脂肪组织经脱细胞后,HE、Masson染色示DAT主要由排列松散的胶原构成,未见细胞核;扫描电镜示DAT中未发现细胞和细胞碎片,同时可见到粗大的胶原纤维束;免疫组织化学染色及Western blot检测示,DAT中保留了Ⅰ、Ⅳ型胶原和层粘连蛋白。经鉴定,hAT-EV呈双层包膜的球形,高表达CD63、凋亡诱导因子6相互作用蛋白抗体、肿瘤易感基因101,97.9%粒径分布范围为32.67~220.20 nm,峰值为91.28 nm。共聚焦荧光显微镜和油红O染色示,hAT-EV被ADSCs摄取并诱导其成脂分化。大鼠体内实验显示,实验组新生脂肪组织湿重显著高于对照组(t=2.278,P=0.048);HE染色示,实验组脂滴结构较对照组多,对照组胶原含量高于实验组;围脂滴蛋白免疫荧光染色示,实验组DAT新生物中脂肪组织比例高于对照组(t=4.648,P=0.017)。结论DAT搭载hAT-EV可作为一种诱导脂肪组织新生的新方法,在软组织缺损修复中具有潜在应用前景。

脂肪干细胞来源外泌体促进糖尿病小鼠创面愈合的实验研究

目的探讨脂肪干细胞来源外泌体(adipose-derived stem cell released exosomes,ADSC-Exos)对糖尿病小鼠创面愈合的影响。方法取患者自愿捐赠脂肪组织,采用酶消化法分离培养ADSCs,并于第3代细胞上清液提取Exos(ADSC-Exos);透射电镜观察ADSC-Exos形态,Western blot检测膜表面标志性蛋白Alix、CD63,纳米颗粒跟踪分析仪检测粒径分布。取患者自愿捐赠皮肤组织,采用酶消化法分离培养成纤维细胞。将PKH26标记的ADSC-Exos与第5代成纤维细胞培养,共聚焦荧光显微镜观察其能否进入细胞,采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)及划痕法观察ADSC-Exos对成纤维细胞增殖及迁移的影响。取24只8周龄Balb/c雄性小鼠制备糖尿病模型后,背部制备直径8 mm全层皮肤缺损创面,实验组(n=12)及对照组(n=12)创面真皮层分别注射0.2 mL ADSC-Exos及PBS。第1、4、7、11、16、21天大体观察创面愈合情况,计算创面愈合率;第7、14、21天取材,行组织学(HE及Masson)及CD31免疫组织化学染色,观察创面结构、胶原纤维及新生血管情况。结果ADSC-Exos为边缘清晰、大小分布均匀的膜性囊泡;粒径为40~200 nm,平均102.1 nm;膜表面标志性蛋白Alix、CD63均呈阳性。ADSC-Exos与成纤维细胞复合培养观察示,ADSC-Exos可进入成纤维细胞胞内,并能促进成纤维细胞增殖及迁移。动物实验显示,实验组小鼠背部创面愈合明显快于对照组,各时间点创面愈合率差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,实验组创面结构愈合更好,愈合前期新生微血管更多,愈合后期胶原纤维沉积更多;其中,第7、14、21天创面缺损长度,第7、14天微血管数量,第14、21天胶原纤维沉积百分比,组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论ADSC-Exos通过促进创面血管新生以及成纤维细胞增殖、迁移和胶原合成来促进糖尿病小鼠创面愈合。

脂肪干细胞来源外泌体促进大鼠皮瓣移植后血管新生的研究

目的探讨脂肪干细胞来源外泌体(adipose-derived stem cell derived exosomes,ADSC-Exos)对大鼠皮瓣移植后血管新生的影响。方法取抽脂术患者自愿捐赠脂肪组织,采用酶消化法分离培养ADSCs;取第3代细胞光镜观察形态,流式细胞术鉴定细胞表面标志物,成脂诱导培养14 d后油红O染色观察。细胞鉴定为ADSCs后,采用密度梯度离心法提取ADSC-Exos;透射电镜观察形态,Western blot检测膜表面标志蛋白(CD63、TSG101),纳米颗粒跟踪分析仪测量其粒径分布。取20只雄性SD大鼠,体质量250~300 g,随机分为ADSCExos组和PBS组,每组10只。两组大鼠背部沿长轴方向制作面积为9 cm×3 cm随意皮瓣后,分别于近端、中间和远端区域注射ADSC-Exos(ADSC-Exos组)或PBS(PBS组)。术后大体观察皮瓣成活情况,第7天测算皮瓣成活率后切取皮瓣组织,HE染色观察组织形态,CD31免疫组织化学染色测定皮瓣微血管密度(mean blood vessel density,MVD)。结果光镜、流式细胞术及成脂诱导培养鉴定培养细胞为ADSCs。ADSC-Exos为边缘清晰、大小形态均匀的圆形或椭圆形膜性囊泡,高表达标志蛋白CD63和TSG101,粒径分布在30~200 nm,符合外泌体粒径范围。术后两组皮瓣远端均出现不同程度坏死表现,但ADSC-Exos组程度较PBS组轻;第7天ADSC-Exos组皮瓣成活率为64.2%±11.5%,显著大于PBS组的31.0%±6.6%(t=7.945,P=0.000);中间区域皮肤附属器官更完整,近端区域组织水肿程度轻、血管扩张更多。ADSC-Exos组MVD为(103.3±27.0)个/视野,显著多于PBS组(45.3±16.2)个/视野(t=3.190,P=0.011)。结论 ADSC-Exos可通过促进皮瓣移植后新生血管的形成,改善皮瓣血供,进而提高大鼠皮瓣成活率。