绵羊FHL2蛋白原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体的制备

通过表达和纯化重组的绵羊FHL2抗原蛋白和制备其多克隆抗体,用于研究该蛋白的生物学功能及绵羊繁殖调控的作用机制。研究采用PCR技术扩增绵羊FHL2蛋白的编码序列,利用限制性内切酶双酶切后插入pET28a-sumo中,加入0.5 M IPTG诱导蛋白表达,利用Ni-NTA纯化获得48 ku的重组FHL2蛋白。以重组FHL2蛋白为抗原,混合佐剂皮下注射免疫BALB/c小鼠,获得抗FHL2的多克隆抗体,间接ELISA检测结果显示抗体效价达到16400。通过转染pEGFP-C1-FHL2质粒至HEK 293F细胞,提取细胞总蛋白,利用制备的抗FHL2多克隆抗体检测蛋白的结合力,具有良好的免疫原性,为研究FHL2蛋白的生物学功能及繁殖调控机制提供良好的基础材料。

目的基因大小对脂质体转染效率影响的研究

目的研究使用脂质体转染时目的基因大小对转染效率影响。方法将大小差异显著的目的基因连接到同一载体,脂质体转染法分别将上述两种目的基因转染至FRT细胞,转染完成24 h后,应用倒置荧光显微镜和流式细胞仪分析转染效率,检测目的基因的大小对转染效率的影响。结果转染效率均随着脂质体用量增加而上升,无论脂质体浓度如何选择,两种真核表达载体的转染效率均有显著性差异,且目的基因越大,转染效率越低。结论目的基因与转染效率成反比。

酵母双杂交技术筛选与绵羊微管解聚蛋白相互作用的蛋白

采用TRIzol法提取绵羊卵巢组织总RNA,运用RT–PCR技术扩增绵羊微管解聚蛋白基因(STMN1)的编码区序列;通过同源重组技术构建重组诱饵表达载体p GBKT7–STMN1,鉴定该诱饵蛋白在酵母双杂交系统中的自激活活性、细胞毒性和表达情况;利用诱饵质粒p GBKT7–STMN1从绵羊卵巢组织细胞的酵母双杂交cDNA文库筛选互作的宿主蛋白。结果显示:成功构建重组诱饵质粒p GBKT7–STMN1,并对酵母细胞无自激活活性和细胞毒性作用,且能在酵母细胞中正常表达;筛选获得12个与STMN1相互作用的克隆,经测序比对分析和点对点验证,得到CREB和FOXM1共2个互作的宿主蛋白,这2个蛋白可能参与调控细胞的增殖、周期、凋亡等过程。

SWELL1真核表达载体的构建及其在哺乳动物细胞的表达

为研究SWELL1容积调控性氯离子通道在多种哺乳动物细胞的表达情况,最终获得表达及功能俱佳的细胞模型。反转录PCR方法从SJSA 1细胞中获得目的基因SWELL1,应用基因同源重组技术将SWELL1克隆入真核表达载体pCMV3-RFP,测序结果表明,成功构建SWELL1真核表达载体;SWELL1转染至HEK293、CHO和FRT细胞中,抗生素筛选和有限稀释后,获得表达SWELL1细胞株;倒置荧光显微镜观察SWELL1的表达情况,并应用荧光淬灭动力学试验检测SWELL1的离子转运功能。结果表明FRT细胞为研究SWELL1的最佳细胞模型,SWELL1是容积调控性氯离子通道的分子基础,具有经典容积调控性氯离子通道的特性。

超纯水对限制性内切酶酶切反应的影响

目的 研究超纯水对限制性内切酶酶切结果的影响。方法 酶切体系中分别使用久置的超纯水和现用现配制的超纯水,以含酶切位点BamHⅠ和EcorⅤ的YFP-pcDNA3.1质粒为实验对象,双酶切后凝胶成像系统检测DNA琼脂糖凝胶电泳后的酶切结果。结果 应用久置的超纯水酶切结果有明显弥散现象,而更换现配制的超纯水,未见酶切弥散现象。结论 超纯水在分子生物学酶切实验中扮演重要角色,酶切实验应选用新制备的超纯水。

基于钙激活氯离子通道的Piezo1通道调节剂高通量筛选模型的构建

目的构建基于钙激活氯离子通道蛋白1(ANO1)的Piezo1调节剂高通量筛选模型。方法RT-PCR和Western印迹法分别检测Fischer大鼠甲状腺上皮(FRT)细胞Piezo1 mRNA和蛋白表达。构建共表达增强型绿色荧光蛋白标记的ANO1(ANO1-EGFP)和黄色荧光蛋白双突变体(YFP-H148Q/I152L)的FRT细胞株(简称FRT模型细胞),倒置荧光显微镜检测ANO1-EGFP和YFP-H148Q/I152L在FRT模型细胞中的表达,加入ANO1激活剂离子霉素10μmol·L^-1,应用荧光淬灭动力学实验检测并计算FRT模型细胞相对荧光强度变化值。加入Piezo1调节剂Jedi1(200μmol·L^-1),Jedi2(150μmol·L^-1),Yoda1(20μmol·L^-1)和Gd3+(20μmol·L^-1),应用荧光淬灭动力学实验检测并计算FRT模型细胞相对荧光强度变化值。加入Piezo1激活剂Jedi1,Jedi2和Yoda1,按0.2,1,5,10,25,50,75,100,200,300,400,500,600,700,800,900和1000μmol·L^-1设置浓度梯度,应用荧光淬灭动力学实验检测并计算FRT模型细胞相对荧光强度变化值并绘制浓度依赖曲线。向FRT细胞中加入Yoda1,按同样的方法设置浓度梯度,通过Fura-2/AM荧光探针检测细胞内的钙信号随Yoda1浓度的变化,分析细胞内Ca^2+浓度与FRT模型细胞相对荧光强度变化值之间的关系。计算模型Z′因子及信噪比。结果RT-PCR、DNA测序比对和Western印迹结果表明,FRT细胞内源性表达Piezo1。ANO1-EGFP和YFP-H148Q/I152L表达清晰,位置正确,并且ANO1-EGFP被离子霉素激活后模型荧光淬灭,证实转染基因表达的蛋白具有生物学活性,FRT模型细胞构建成功。FRT模型细胞加入Jedi1,Jedi2和Yoda1荧光均淬灭,加入Gd3+后再加入Yoda1荧光不淬灭,证实模型可以用于筛选Piezo1通道调节剂;在FRT模型细胞中离子霉素的EC50为(7.76±0.53)μmol·L^-1,Yoda1的EC50为(17.27±1.21)μmol·L^-1,Jedi1的EC50为(200.60±4.46)μmol·L^-1,Jedi2的EC50为(158.10±4.65)μmol·L^-1。FRT模型细胞相对荧光强度变化值与细胞内Ca^2+浓度呈正相关,模型能敏感地反应细胞内钙信号变化。模型Z′因子为0.82,信噪比为13.29∶1,可用于Piezo1通道调节剂高通量筛选。结论成功构建了可快速、准确、便捷筛选Piezo1通道激活剂和抑制剂的高通量筛选模型。

模板质量对RT-PCR结果的影响及分析

目的探究模板质量对RT-PCR结果的影响及分析其影响因素。方法从大鼠甲状腺滤泡上皮细胞中提取总RNA进行逆转录,产物进行PCR、NanoDrop检测其质量。选用不同浓度PCR产物及加入不同浓度标准蛋白(BSA)进行PCR,并进行琼脂糖凝胶电泳。凝胶成像仪分析不同浓度蛋白质对PCR终产物量的影响,Image J软件对PCR产物定量分析。结果模板质量低时,模板量与PCR产物量成反比,且选取质量不佳的模板会产生非特异性条带;模板质量高时,模板量与PCR产物量成正比,且未见非特异性条带;模板受杂质污染(如蛋白质污染)时,在模板量相同情况下,蛋白浓度越高,PCR产物的量越低。结论模板质量严重影响RT-PCR结果,模板质量低时,应减少模板的量。