辣木MoGAD基因克隆及表达分析

【目的】鉴定辣木中MoGAD基因,并对其进行克隆、生物信息学分析和表达水平分析,为探究辣木MoGAD基因的功能与γ-氨基丁酸(GABA)生物合成的关系奠定基础。【方法】以拟南芥(NP_197235.1)和葡萄(XP_002285268.1)GAD蛋白序列为参考,通过本地BLAST方法,利用TBtools软件在辣木转录组数据中挖掘MoGAD家族基因,采用PCR技术对其进行克隆,并通过生物信息学在线分析网站和分子对接技术分析MoGAD蛋白的理化性质和催化活性位点,采用实时荧光定量RT-qPCR技术分析MoGAD基因在不同组织中的表达水平。【结果】在转录组数据中挖掘到4个MoGAD基因并成功对其进行克隆,测序的CDS区长度分别为:1494、1212、1470和942 bp;MoGAD1、MoGAD3和MoGAD4蛋白不存在跨膜结构域,属于膜外蛋白。其中MoGAD2蛋白序列在第5~27和60~82氨基酸位置存在跨膜结构,此段序列编码蛋白为分泌蛋白;系统发育分析显示MoGAD1基因家族所在分支基因Motif数量最多;分子对接表明4个MoGAD蛋白存在磷酸吡哆醛(PLP)和L-谷氨酸结合位点,且每个蛋白有多个氨基酸残基与PLP,L-谷氨酸形成氢键;荧光定量分析显示MoGAD1和MoGAD2基因在嫩叶、成熟叶和花中的表达量显著高于MoGAD3和MoGAD4基因,但这些基因在茎中表达量较低,推测MoGAD酶主要参与辣木叶部位GABA的生物合成。【结论】本研究成功克隆了辣木的MoGAD基因,并分析其编码蛋白的理化性质及与底物结合的功能活性位点,为进一步研究MoGAD基因的功能提供了理论依据。