鞘氨醇1磷酸及其受体在粒细胞集落刺激因子诱导造血干/祖细胞动员过程中的表达变化

目的探讨鞘氨醇1磷酸(S1P)及其受体在粒细胞集落刺激因子(G-CSF)诱导的造血干/祖细胞(HSPC)动员中的表达变化。方法 6周清洁级雄性C57BL野生型小鼠18只,按随机数字表法分为对照组、动员3 d组、动员5 d组,每组6只。对照组给予腹部皮下注射无菌生理盐水100μl/d,连续5 d;动员3 d组连续腹部皮下注射G-CSF 3 d;动员5 d组连续腹部皮下注射G-CSF 5 d。应用流式细胞仪检测3组小鼠外周血Lin-Sca1±c Kit±(LSK)细胞水平,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测外周血S1P水平,RT-PCR检测骨髓S1PR1 mRNA水平。结果 LSK细胞水平动员5 d组>动员3 d组>对照组(P<0.05),说明动员成功。动员3 d组外周血S1P水平明显大于动员5 d组、对照组(P<0.05),但动员5 d组与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。骨髓S1PR1 mRNA水平动员5 d组>动员3 d组>对照组(P<0.05)。结论在G-CSF诱导的HSPC动员过程中,外周血S1P水平升高以及骨髓S1PR1表达升高,可能有利于G-CSF介导HSPC动员的发生。

促血管生成素-1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带小鼠促血管生成素-1(Ang-1)基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法化学合成小鼠Ang-1基因经PCR扩增后亚克隆至穿梭质粒,重组质粒转化感受态细胞,所得转化子经PCR电泳分析并测序鉴定,携带外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组的辅助包装质粒共转染人胚肾细胞系HEK 293细胞,反复冻融获取重组腺病毒,终点稀释法测定重组腺病毒滴度,所得腺病毒转染293T细胞48 h收集培养上清,通过Western Blot分析Ang-1蛋白的表达。结果 PCR产物电泳分析可见大小约1.5 kbp的特征性条带,测序结果显示基因序列与Gen Bank提供的Ang-1序列一致,经HEK293细胞包装后腺病毒滴度为1×109pfu/ml,转染293T细胞后培养上清Western Blot分析可见大小58 k D特征性条带,即转染后能分泌正确大小的重组Ang-1蛋白。结论 Ang-1基因重组腺病毒载体可成功构建,为进一步研究Ang-1蛋白对造血干细胞动员及血管新生的作用提供实验依据。

血管生成素1在G-CSF诱导的造血干/祖细胞动员中的表达变化

目的 探讨G-CSF诱导的造血干/祖细胞（HSPC）动员过程中血管生成素1（Ang1）在小鼠骨髓的表达变化及导致其变化的机制.方法 采用流式细胞术检测小鼠动员前及动员后外周血Lin Scal＋cKit＋（LSK）细胞比例变化,并应用ELISA、免疫组化、RQ-PCR等方法检测G-CSF动员不同时间点小鼠外周血和骨髓标本,观察Ang1、骨钙素（OCN）基因及蛋白水平变化,显微镜下计数骨髓标本成骨细胞数量.结果 G-CSF动员5d小鼠外周血LSK细胞比例为（0.61±0.05）％,相对于对照组的（0.04±0.01）％显著增高（P＜0.05）;稳态小鼠OCN及Ang1 mRNA在骨内膜细胞表达高于骨髓有核细胞;动员后骨内膜细胞OCN及Ang1 mRNA相对表达量对照组（28.64±8.61及2.84±0.95）、G-CSF动员3d组（12.55±7.06及0.93±0.30）及动员5d组（4.75±1.62及0.92±0.22）均下降;动员后骨内膜成骨细胞数量显著减少,骨髓组织Ang1蛋白表达下降;对照组、动员3d及5d组外周血OCN及Ang1浓度分别为（24.11±3.17）及（2.24±0.52）ng/ml、（9.96±2.16）及（1.21±0.38）ng/ml和（8.43±2.62）及（0.90±0.24）ng/ml,动员3d及5d组均明显低于对照组,差异均有统计学意义（P值均＜0.05）.结论 在G-CSF介导的HSPC动员过程中,骨髓微环境中成骨细胞数量下降、功能减低,进而导致骨髓Ang1表达下降,导致骨髓对HSPC的趋化和黏附能力下降,有利于HSPC动员的发生.