活体染料CFDA-SE在淋巴细胞增殖研究中的应用

目的 :探讨活体染料CFDA SE在淋巴细胞增殖研究中的应用价值。方法 :利用CFDA SE染色、荧光抗体标记和流式细胞术 ,检测淋巴细胞及其亚群在多克隆刺激剂作用下荧光强度的变化 ,并应用相关软件分析其增殖情况。结果 :PDB +ion omycin或ConA刺激 4 8h后均出现淋巴细胞分裂 ,表现为CFSE荧光强度的系列减半。环孢菌素A(CsA)可抑制ConA促进淋巴细胞增殖的作用 ,CFSE荧光无减半。ConA刺激4 8h后 ,出现CD4 + T细胞和CD8+ T细胞增殖不同步的现象 ,72h后这一现象更加明显。经ModFitTM 软件拟合后 ,得到的各项增殖指标显示 ,ConA对CD8+ T细胞的促增殖作用强于对CD4 + T细胞的作用。结论 :CFDA SE染色结合荧光抗体标记和流式细胞术 。

喘可治注射液对人外周血单个核细胞Th1/Th2细胞因子谱的影响

目的:通过研究喘可治注射液对人外周血单个核细胞(PBMCs)Th1/Th2细胞因子谱的影响,探讨喘可治注射液的免疫调节作用机制。方法:以流式微球分析(CBA)法检测不同处理情况下,人外周血单个核细胞分泌Th1(IFN-γ、TNF-α、IL-2)和Th2(IL-4、IL-6、IL-10)细胞因子水平。结果:健康人PBMCs体外培养12小时后,上清中细胞因子主要为TNFα和IL6,喘可治使Th1和Th2细胞因子全面升高;喘可治对PDB加离子霉素诱导的PBMCs分泌Th1和Th2细胞因子具有抑制作用,并能抑制流感病人异常升高的INF-γ、TNF-α、IL-6和IL-10分泌。结论:喘可治注射液上调健康人PBMCs分泌Th1和Th2细胞因子,对异常活化的PBMCs分泌的Th1和Th2细胞因子则具有下调作用。

联合应用活体染料CFDA-SE和SNARF-1检测混合淋巴细胞反应

目的建立一种能够对单向混合淋巴细胞反应中应答细胞的应答强度进行更全面评价的增殖检测方法。方法BALB/cJ小鼠淋巴结细胞经CFDA-SE标记后作为应答细胞,BALB/cJ或C57BL/6小鼠脾细胞经丝裂霉素C处理后再用SNARF-1标记,作为刺激细胞,进行混合培养。混合培养96h后收获细胞,用流式细胞术进行检测,分析SNARF-1-CFSE+应答细胞的增殖情况,并用ModFitTM软件拟和以获得更多增殖相关指数。结果随着应答细胞分裂代数的增加,CFSE荧光强度逐渐减弱直至与刺激细胞无法分开,通过划除SNARF-1阳性细胞以确定应答细胞,解决了这一问题。应用ModFitTM软件,获得应答细胞的前体频率和增殖指数等多项重要的增殖相关指标。结论联合应用CFSE和SNARF-1染色,结合流式细胞术,可作为评价混合淋巴细胞反应中应答细胞的应答强度的有力工具。

妊娠期调节性T细胞介导保护性效应需要同种抗原的刺激

越来越多的证据表明,人和小鼠妊娠期CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)参与介导母胎免疫耐受。然而,目前对于妊娠期间调控Treg变化的因素还不清楚,对同基因交配(BALB/c×BALB/c)和异基因交配(BALB/c×C57)小鼠以及妊娠妇女CD4+CD25+Treg进行了分析,以探讨雌、孕激素和胎儿同种异基因抗原对Treg的影响。发现异基因孕鼠外周淋巴器官CD4+CD25+T细胞于早孕、中孕期明显高于非孕对照,而在同基因孕鼠只有少数个例升高;这些CD4+CD25+T细胞均表达Foxp3蛋白,在体外具有无反应性和免疫抑制能力;而且异基因孕鼠淋巴细胞对父方同种抗原的应答强度明显弱于同基因孕鼠。对去势的雌鼠给予雌二醇或孕酮,使其在血清中浓度接近中孕水平,未发现外周血CD4+CD25+Treg的明显变化。妊娠妇女CD4+CD25highTreg在早孕、中孕期显著升高,临近分娩期降至非孕水平,而此时CD4+CD25lowT细胞反而增加。以上结果表明,异基因抗原的存在对于妊娠期CD4+CD25+Treg介导对胎儿的免疫保护效应具有重要作用,而CD4+CD25+Treg的消失可能与分娩的发动有一定关系。

MLR中刺激细胞活化状态对应答T细胞CD69表达的影响

目的 :研究混合淋巴细胞反应 (MLR)中刺激细胞的活化状态对应答T细胞活化的影响 ,为指导临床的组织器官移植提供一定理论依据。方法 :混合淋巴细胞培养 (MLC)前对刺激细胞进行不同预处理以改变其功能状态 ,利用单克隆抗体与流式细胞术 ,在混合培养后不同时点对各组应答T细胞活化表面分子CD69的表达程度进行分析。结果 :在培养 2 4h、48h和 72h后 ,MLCa组 (刺激细胞经预先活化组 )应答T细胞的CD69表达百分率均明显高于MLC组 (刺激细胞未经预先活化组 ) ,分别为 5 2 1 %± 0 2 4 %vs 1 98%± 0 33 % ,2 9 81 %± 0 85 %vs 2 0 65 %±1 0 0 %和 39 61 %± 1 62 %vs 1 3 49%± 0 60 % ,(P <0 0 1 )。结论

佛波醇酯加离子霉素诱导脐血和成人外周血CD4^+CD25^+ T细胞分泌IL-2的相关机制研究

目的:以佛波醇酯加离子霉素作为刺激剂,验证CD4+CD25+调节性T细胞本身并不存在分泌IL-2障碍;同时通过对脐血和成人外周血的比较性研究,了解脐血CD4+CD25+T细胞的成熟度。方法:以autoMACS从足月婴儿脐血(CB)和成人外周血(PB)分选CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞,以PDB+ionomycin作为刺激剂,培养45h后流式细胞术检测各组细胞表达CD69和CD25水平,并以Luminex多重细胞因子检测技术检测培养上清中7种细胞因子的浓度。结果:经PDB+ionomycin刺激后,CB、PB的CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞均发生增殖,但在培养45h后CD4+CD25+T细胞均出现细胞状态变差或死亡倾向。CB、PB的CD4+CD25+T细胞活化后CD25分子表达进一步上调,高于CD25-细胞活化后的CD25分子密度。经PDB+ionomycin刺激后,PB CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞均分泌高水平的IFN-γ、IL-2和TNF-α,但CD25+细胞分泌IL-5、IL-4和IL-10水平远远高于CD25-细胞;CBCD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞亦分泌高水平的IL-2和TNF-α,但IFN-γ水平远远低于PB,基本不分泌IL-5、IL-4和IL-10。结论:CD4+CD25+T细胞本身并不存在合成和分泌IL-2障碍,其可能具有与传统T细胞不同的T细胞受体信息转导模式;脐血CD4+CD25+T细胞功能尚未完全成熟。

CD4^+CD25^+调节性T细胞的发育与胸腺CD4^-CD25^+细胞关联性的探讨

目的:探讨CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+regulatoryTcells,CD4+CD25+Tr)的发育及其与胸腺CD4-CD25+细胞的关系。方法:以流式细胞术检测小鼠从出生至发育成熟过程中,胸腺、脾脏、淋巴结和外周血中CD4+CD25+Tr比例变化,以及胸腺CD4-CD25+细胞比例变化;通过磁激活细胞分选(MACS)从小鼠淋巴结纯化CD4+CD25+T和CD4+CD25-T细胞,经CFDA-SE标记,以多种刺激形式诱导增殖。结果:小鼠出生1d到10周的发育过程中,胸腺CD4+CD25+Tr比例一直比较恒定,但在脾脏、淋巴结和外周血,随鼠龄增加而不断升高,从1d龄到1周时升高最迅速,其后的升高速度逐渐减慢,10周龄时达平台期。胸腺中CD4-CD25+细胞在出生1d的小鼠比例非常高,1d龄到1周龄期间迅速下降,10周龄时达平台期。ConA不能诱导CD4+CD25+Tr和CD4+CD25-T细胞增殖,但CD4+CD25+Tr出现一过性细胞增大;佛波醇酯加离子霉素能诱导CD4+CD25+Tr和CD4+CD25-T细胞增殖;包被的抗CD3抗体加可溶性抗CD28抗体能刺激CD4+CD25-T细胞增殖,但CD4+CD25+Tr不增殖,加入高浓度IL-2,CD4+CD25-T细胞增殖更强,CD4+CD25+Tr出现增殖。结论:胸腺CD4-CD25+细胞很有可能是CD4+CD25+Tr的前体。

雌二醇、孕酮对小鼠同种异基因移植物的影响

目的通过研究雌二醇(E2)、孕酮(P4)对小鼠同种异基因移植物存活时间的影响,探讨妊娠期间母体外周血中雌、孕激素水平对母体免疫应答能力以及对母胎免疫耐受的影响。方法雌性受体小鼠通过切除双侧卵巢去势,胃饲E2或P4,使外周血E2或P4浓度达到相当于小鼠妊娠中期水平。以腹腔注射CsA的小鼠作为对照,进行耳后同种异基因半心移植,观察各组移植物存活时间,并取移植部位组织进行石蜡切片HE染色。结果同基因移植组心肌长期存活(>300 d),异基因移植对照组心肌平均存活时间为(12.8±0.8)d。与异基因移植对照组比较,CsA组心肌存活时间显著延长(>20 d),P<0.01;E2组移植心肌存活时间显著缩短(9.7±0.5)d,P<0.01;P4组心肌存活时间与对照组比较无显著差异,平均(12±0.6)d,P>0.05。结论妊娠期母体外周血中E2和P4水平对母体的系统性免疫应答无明显抑制作用,不是维持非胎盘部位母胎免疫耐受的主导性因素。

人胎盘绒毛提取物体外对T细胞应答的抑制效应

目的:了解胎盘绒毛对T细胞应答的抑制能力及其在妊娠周期不同阶段的变化.方法:制备孕10,20和37wk的绒毛提取物,通过检测CD69和CD25分子的表达,评价其对T细胞活化的影响,WST-1法分析其对T细胞增殖的影响,流式微球阵列(CBA)法分析其对Th1/Th2细胞因子谱的影响,并以Western印迹法分析提取物中吲哚胺-2,3双加氧酶(IDO)的含量.结果:孕早、中、晚期的胎盘绒毛提取物均能显著抑制植物血凝素(PHA)诱导的人T细胞活化,增殖,细胞因子分泌以及ConA诱导的小鼠T细胞活化(P<0.01).但三个时期的提取物对上述不同T细胞行为的抑制强度不同,以20wk提取物的抑制作用最强.提取物中IDO蛋白的含量20wk最高,37wk次之,10wk最低.结论:妊娠不同时期的绒毛滋养细胞均能够抑制T细胞应答,但抑制强度不一致,且对T细胞不同行为的抑制存在分离现象,提示妊娠不同时期的绒毛滋养细胞表达抑制因子的模式不同.

调节性T细胞介导异基因交配孕鼠对父方抗原同种反应性的影响

目的研究怀有同种异基因胚胎对母体对父方抗原同种反应性的影响及其相关机制。方法采用CFSE标记应答细胞、SNARF-1标记刺激细胞的单向混合淋巴细胞培养体系,对孕10.5d的同基因交配孕鼠BALB/c×BALB/c(syn-BALB/c)和异基因交配孕鼠BALB/c×C57(allo-BALB/c)对C57小鼠同种抗原的应答强度进行比较;流式细胞术检测CD4+CD25+T细胞在syn-BALB/c和allo-BALB/c各淋巴器官的比例变化,及其胞内Foxp3表达。结果孕10.5d的allo-BALB/c对C57同种抗原的应答强度明显低于syn-BALB/c,但将应答细胞中的CD4+CD25+T细胞去除后,应答强度反而高于syn-BALB/c。allo-BALB/c脾脏、淋巴结和外周血CD4+CD25+T细胞明显高于syn-BALB/c,这些细胞均表达高水平的Foxp3。结论异基因交配孕鼠对父方抗原的同种反应性较同基因交配孕鼠降低,这一现象很可能是由CD4+CD25+Treg介导的。

同种异基因移植引流淋巴结及外周血T细胞活化分析

目的 :研究同种异基因移植早期局部引流淋巴结和外周血T细胞的活化情况。方法 :以小鼠前臂皮下非血管化心肌移植为模型 ,利用流式细胞术分析前臂引流淋巴结及外周血不同T细胞亚群的CD69表达水平。结果 :同种异基因移植后 72h,引流淋巴结CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的CD69表达百分率均明显高于移植前 (P <0 0 1 ) ,且CD8+ T细胞的表达水平高于CD4+ T细胞 (P <0 0 1 ) ;各组外周血CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的CD69表达百分率均无显著差异 ;局部应用弗氏完全佐剂和全身应用CsA可分别增强和抑制同种异基因移植后CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的CD69表达 (P <0 0 5或P <0 0 1 )。结论

雷公藤甲素对小鼠淋巴细胞体外活化的抑制作用

目的研究雷公藤甲素(TRD)对小鼠T淋巴细胞活化标志CD69、CD25及细胞因子IL2及IFNγmRNA表达的影响,为阐明其免疫抑制作用提供分子药理学依据。方法无菌分离小鼠淋巴结细胞,加入不同浓度的雷公藤甲素预先孵育1h,用多克隆刺激剂刀豆蛋白(ConA)刺激T细胞活化,利用荧光标记的单克隆体双染技术,流式细胞仪检测TRD对小鼠T细胞CD69、CD25表达的影响;采用半定量RTPCR技术从mRNA水平检测TRD对细胞因子IL2、IFNγmRNA的表达的影响。结果TRD能抑制T细胞早期活化标志CD69和CD25,同时TRD也能抑制IL2及IFNγmRNA的表达。结论TRD对T细胞早期活化分子及细胞因子表达的抑制作用可能是其发挥免疫抑制作用的机制之一。

青藤碱对T淋巴细胞活化及TH1类细胞内细胞因子表达的影响

目的 :深入研究青藤碱对T淋巴细胞Th1类细胞因子表达的影响。方法 :分离小鼠淋巴结细胞 ,加入不同浓度的青藤碱作用 1小时后 ,加多克隆刺激剂PDB和离子霉素 ,继续培养 4小时后收获细胞 ,进行细胞内细胞因子染色 ,以流式细胞术对T细胞Th1类细胞因子TNF γ、炎症性细胞因子TNF α分子表达情况进行分析 ;同时 ,观察药物对T细胞活化早期标志CD6 9表达的影响 ;结果 :10 0 0 μmol L(32 9 2 4 μg ml)青藤碱能够抑制CD6 9表达 ,2 0 0 μmol L青藤碱对CD6 9表达无影响 ;2 0 0、10 0 0、2 0 0 0 μmol L青藤碱能够剂量依赖性地显著降低T细胞内细胞因子TNF γ、TNF α分子表达。 结论 :抑制T细胞活化异常可能是青藤碱治疗类风湿关节炎免疫药理机制之一 ,此抑制效应可能主要不是通过影响PKC而是与影响钙离子依赖的T细胞活化信号传导途径相关。

靛蓝和靛玉红对小鼠T细胞活化与增殖的影响

目的:研究靛蓝(IB)和靛玉红(IR)对小鼠T细胞活化和增殖的影响。方法:以刀豆蛋白A(ConA)诱导小鼠T细胞活化和增殖,利用流式细胞术检测T细胞早期活化标志CD69分子表达情况;通过2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-苯二磺酸)-2H-四唑单钠盐(WST-1)法测定细胞增殖;通过CFDA-SE染色流式细胞术检测增殖细胞各代所占比例和增殖指数(PI)。结果:小鼠T细胞离体培养6 h后,对照组活化比率为(14.25±2.25)%,在ConA的刺激下小鼠T细胞活化显著(35.25±2.31)%(P<0.01),IB和IR分别显著降低活化,(26.88±0.99)%和(23.98±2.25)%(P<0.01)。在ConA的刺激下,小鼠T细胞WST-1吸收度(1.28±0.09)显著高于对照组(0.33±0.02)(P<0.01)。IB和IR分别显著降低了ConA引起的WST-1吸收度增加(P<0.01)。在培养48 h后,空白对照组CFDA-SE流式细胞术检测结果仅显示单一亲代峰(parent),PI为1.0。ConA刺激下小鼠T细胞明显增殖,出现子一代和子二代峰,PI为1.36。在IB或IR作用下,ConA介导的小鼠T细胞增殖明显下降,亲代峰细胞数增多,子一代和二代的细胞数降低,PI均为1.22,低于ConA组。结论:靛蓝和靛玉红均可以显著的抑制ConA介导的小鼠T细胞的活化和增殖。

杨梅素对淋巴细胞活化及增殖的影响

目的研究杨梅素(myricetin)对小鼠T细胞活化及增殖的影响,探讨其作为免疫调节药物开发的可能性并提供相关实验依据。方法无菌分离小鼠淋巴结细胞,加入不同浓度的杨梅素预先孵育1h,用多克隆刺激剂刀豆蛋白(ConA)刺激T细胞活化,利用荧光标记的单克隆抗体双染技术,流式细胞仪检测杨梅素对小鼠CD3+T细胞CD69表达的影响;采用3H-TdR参入法检测杨梅素对淋巴细胞增殖的影响,采用半定量RT-PCR技术从mRNA水平检测杨梅素对IL-2mRNA表达的影响。采用ELISPOT检测杨梅素对IFN-γ分泌的影响。结果杨梅素能抑制T细胞早期活化标志CD69的表达,并能抑制淋巴细胞增殖反应,同时对淋巴细胞活化后IL-2 mRNA的表达及IFN-γ的分泌也有抑制作用。结论杨梅素对淋巴细胞的活化增殖反应具有抑制作用。

人外周血CD8^+T细胞CD28、CD56及CD57表达水平的老年性改变

目的 :通过对健康老年人与青年人外周血CD8+T细胞CD2 8、CD5 6及CD5 7表达水平的比较性研究 ,探讨免疫衰老的细胞学机制。方法 :采用三色免疫荧光标记流式细胞术分析青年组 ( 2 0 - 35岁 )与老年组 ( 6 0 - 75岁 )外周血CD8+CD2 8+、CD8+CD5 6 +及CD8+CD5 7+T细胞水平。结果 :老年组外周血CD8+CD2 8+T细胞明显低于青年组 ,阳性百分率分别为 34 0 7± 5 2 9和 49 84± 7 43(P <0 0 5 ) ;而老年组CD8+CD5 6 +T细胞及CD8+CD5 7+T细胞均明显高于青年组 ,前者阳性百分率分别为 6 6 0± 2 40和 2 10± 0 35 ,后者阳性百分率分别为 41 82± 6 0 1和2 2 89± 2 80 (P <0 0 5 )。结论 :老年人CD8+T细胞CD2 8、CD5 6及CD5 7的表达率均随年龄增长有明显改变 ;CD2 8表达下降可能是引起免疫系统功能降低的重要原因 ,而CD5 6、CD5 7表达水平的增加则可能是机体对细胞免疫功能下降的一种代偿性适应。

VEGF诱导血管内皮细胞产生H_2O_2及其促增殖作用

目的:研究VEGF诱导血管内皮细胞产生细胞外H2O2及其在VEGF促血管内皮细胞增殖功能中的作用。方法:①以H2DCFDA为H2O2指示剂,检测500μg/LVEGF刺激下,血管内皮细胞H2O2的产生;②以MTT法检测3×106U/L过氧化氢酶(CAT),及外源性加入5-20mmol/LH2O2对VEGF促增殖功能的影响。结果:①在VEGF刺激血管内皮细胞15min后,细胞内开始出现逐渐增强的荧光,且随时间逐渐增强,至45min左右最强,随后逐渐减弱;而同时加入过氧化氢酶组的细胞则仅有微弱荧光产生,且荧光强度不随时间变化;②3×106U/L过氧化氢酶对VEGF的促增殖功能有明显的抑制作用(P<0.01);③外源性加入5-10mmol/LH2O2时对血管内皮细胞有明显促增殖作用(P<0.01),但其对VEGF的促增殖功能却有显著抑制作用(P<0.01)。结论:VEGF可刺激血管内皮细胞产生细胞外H2O2,在促细胞增殖中可能具有重要作用。而外源性H2O2对VEGF的生理功能可能具有抑制作用。

免疫治疗对母胎交界面NK细胞表面CD69表达水平的影响及其与鼠胚和鼠仔预后的关系(英文)

目的 :研究反复自然流产 (recurrentspontaneousabortion ,RSA)模型CBA/J×DBA/ 2小鼠母胎交界面NK细胞表面CD69分子的表达水平 ,并评价淋巴细胞免疫治疗 (lymphocyteimmunotherapy,LIT)对CD69表达水平的影响及其与鼠胚和鼠仔预后的关系。方法 :评价CBA/J×DBA/ 2、C57BL/ 6×DBA/ 2和BALB/c×DBA/ 2小鼠胚胎和鼠仔的预后 ,绘制出生后 1 - 2 1d鼠仔离乳前生长曲线和Kaplan -Meier生存分析曲线。并且采用PE -CD69和FITC -DX5双色流式细胞术检测在有或无LIT的情况下 ,母胎交界面NK细胞表面CD69分子的表达水平。此外 ,对CD1 6/CD32 +NK细胞亚群等也进行检测。结果 :在孕期母鼠体重平均增长幅度、平均每窝产仔数、新生鼠仔出生第 1d平均体重和胚胎吸收率等方面 ,CBA/J×DBA/ 2小鼠与生殖力正常的对照组相比均有显著差异。在CBA/J×DBA/ 2小鼠中 ,代表活化型NK细胞的CD69+ DX5+ 细胞比率也显著高于对照组。而有效的LIT能够显著降低CD69在母胎交界面NK细胞表面的表达水平 ,并相应地显著降低胚胎吸收率。结论 :CD69+ DX5+ 细胞在胚胎被排斥的机制中可能具有重要作用。

地塞米松影响小鼠胸腺细胞c-Myc表达以及凋亡研究

目的 :研究在地塞米松 (DEX)诱导的小鼠胸腺细胞凋亡过程中c -Myc信号变化特点及其与下游caspase - 3变化的相关性 ,以进一步探讨c -Myc在小鼠胸腺细胞凋亡过程中的作用机制。方法 :以终浓度 1μmol/L地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡 ,通过AnnexinV -FITC/PI双染流式细胞术测定 30min、3h、6h和 9h凋亡和坏死细胞比率 ,在 6h时点电镜观察细胞形态 ,利用SDS -PAGE及Westernblot检测 0min、30min、1h和 3h细胞内c -Myc和caspase - 3信号变化特点。结果 :在 1μmol/LDEX诱导下 ,小鼠胸腺细胞在 30min、3h、6h和 9h凋亡比率分别为(5 70± 0 4 6 ) %、(35 79± 1 13) %、(5 0 6 1± 2 15 ) %和 (35 5 2± 1 6 6 ) % ,对照组分别为 (5 97± 0 2 5 ) %、(10 2 0±0 71) %、(12 10± 0 6 6 ) %和 (15 4 5± 0 5 1) % ,组间差异显著 (P <0 0 1)。相应DEX组坏死比率分别为 (4 5 8±0 5 1) %、(4 6 6± 0 6 7) %、(2 5 36± 1 6 4 ) %和 (46 99± 2 6 7) % ,对照组分别为 (4 38± 0 39) %、(4 19± 0 73) %、(9 6 3± 1 2 5 ) %和 (13 38± 0 72 ) % ,组间差异显著 (P <0 0 1) ;电镜观察结果显示DEX处理 6h见较多典型凋亡细胞。对照组在 0min即可检测到c -Myc的明显表达 ,30min略见增多 ,1h?