柑橘香橙素生成途径关键酶黄烷酮-3-羟化酶特性分析及原核表达

香橙素是柑橘类黄酮的重要组成,黄烷酮-3-羟化酶是香橙素生成途径中的关键作用酶。对黄烷酮-3-羟化酶的特点进行总结与分析并在大肠杆菌中进行表达。首先从NCBI数据库筛选了来自柑橘、陆地棉、玉米、水母雪莲和欧芹的5种f3h,对其进行理化性质、蛋白质二三级结构、序列比对等生物信息学分析并以大肠杆菌为宿主进行表达。发现5种来源的f3h,其基因开放阅读框为1032~1119 bp,编码343~372个氨基酸,蛋白分子质量为38.89~41.45 kDa,理论等电点在5.43~5.96,且不同物种F3H的理化性质、结构域和蛋白质结构也有一定的相似性。通过构建大肠杆菌表达体系发现:黄烷酮-3-羟化酶均能进行原核表达,除去来源于水母雪莲的F3H未检测到香橙素的生成,其余4种F3H均能将柚皮素转化为香橙素且产物生成量不同,其中ZmF3H生成量最高达20.12 mg/L。

玉米黄烷酮-3-羟化酶原核表达条件对香橙素生成量的影响

香橙素是类黄酮代谢途径中重要的中间化合物,黄烷酮-3-羟化酶(flavanone-3-hydroxylase,F3H)能以柚皮素为底物催化C;位接羟基从而生成香橙素。为实现香橙素绿色发展,该研究利用微生物法,对来自玉米的Zmf3h构建大肠杆菌原核表达系统后诱导ZmF3H蛋白表达。通过发酵实验验证ZmF3H在胞内可溶性表达并成功催化生成香橙素。为提高香橙素产量,对蛋白表达阶段的菌体密度、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度等条件进行优化实验。单因素试验结果表明各实验组分别在菌种密度OD;=0.8~1.0,IPTG终浓度为0.6 mmol/L,诱导温度在23℃,诱导8 h时可明显提高香橙素生成量,综合各单因素优化条件进行实验验证后发现香橙素生成量为(32.27±1.98)mg/L,与初始条件相比提高了60.39%。

黄烷酮-7-O-葡萄糖基转移酶(UF7GT)的生物信息学分析

黄烷酮-7-O-葡萄糖基转移酶(UDP-glucose:flavanone 7-O-glucosyltransferase,UF7GT)是柑橘类植物中黄烷酮-7-O-葡萄糖苷类化合物生物合成途径的关键酶之一。本研究利用生物信息学相关分析工具对不同植物来源的43个UF7GT的一级结构、二级结构及三级结构等进行分析与预测,并构建了该家族系统进化树。结果表明,UF7GT基因开放阅读框架(open reading frame,ORF)为1326~1926 bp,编码440~500个氨基酸,理论等电点均低于7,大部分是亲水蛋白,不含信号肽和导肽,部分稳定;除葛麻姆来源的UF7GT蛋白含两个跨膜螺旋结构,其他均无跨膜结构;亚细胞定位预测结果表明,UF7GT最大可能定位在质膜或细胞质上;二级结构组成比例相似,α-螺旋和无规则卷曲是主要的结构元件,属于GT-B超家族成员,多数蛋白在进化上高度保守。分析结果为植物UF7GT的功能研究及黄烷酮糖苷的生物合成提供理论依据。

类黄酮O-甲基转移酶(FOMT)的生物信息学分析

类黄酮O-甲基转移酶(flavonoid O-methyltransferase,FOMT)是黄酮类化合物后修饰的关键酶,为进一步了解FOMT蛋白功能及特性,本研究采用生物信息学分析方法,对已在NCBI注册的50种FOMT蛋白的理化性质、蛋白质二、三级结构、信号肽等进行分析。结果表明,50种不同来源的FOMT氨基酸数目在186~391;蛋白分子量介于20.8~43.4 kD;理论等电点为4.82~6.37,均为酸性蛋白质;脂肪指数介于84.82~109.01;不稳定系数介于19.85~51.85,其中13种为稳定蛋白质,37种为不稳定蛋白质;亲疏水性分析显示,其中15种为疏水蛋白,25种为亲水蛋白。50种FOMT中仅有葛根来源的F3’-OMT含有跨膜结构,其余均为膜外蛋白。所有FOMT均属于AdoMet-MTase超家族蛋白。该结果以期为今后深入研究FOMT功能和甲基化黄酮类化合物的生物合成提供理论依据。