菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因在棉花中的过量表达和抗冻耐逆性分析

分离出菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因(SoBADH)构建成由CaMV35S驱动的双元植物表达载体pBSB,农杆菌菌株LBA4404携带该载体转化棉花,获得转基因棉花植株。65株转基因植株经过PCR筛选、Southern blotting分析证明有45株为成功的转化株,外源基因已经被整合到棉花的染色体组中,并以单拷贝插入居多。对部分株系的SoBADH基因的表达进行分析表明均有较高的mRNA和蛋白的表达。经测定这些株系中的甜菜碱脱氢酶活性显著提高,达到0.66～1.70nmol/min/mg水平。同时这些转基因株系在盐胁迫下比对照长势强,株高和地上部分的鲜重显著高于非转基因对照;在低温胁迫下,这些转基因株系表现出显著的抗冻性能。结果表明菠菜甜菜碱醛脱氢酶能够在异源植物棉花中过量表达,并具有较高的酶活性,转基因棉花可作为抗逆育种的种质材料。

转两类抗虫基因棉花优良纯合品系的选育

用含合成的Cry1Ac杀虫蛋白嵌合基因 (Bt2 9K)及慈菇蛋白酶抑制剂B(API B)基因表达框的双抗虫基因植物表达载体 ,通过根癌农杆菌介导转化棉花生产品种冀合 32 1,获得了一批抗卡那霉素的转化再生植株。在对转化再生植株进行PCR、卡那霉素抗性和抗虫性测定的基础上 ,经 6代筛选培育出棉铃虫抗性 90 %以上且农艺性状优良的 9个转双抗虫基因棉纯合品系。各纯合株系子代植株的抗虫性及部分序列检测结果进一步表明上述Cry1Ac嵌合蛋白基因是能稳定遗传的。这些品系具有很好的农艺性状 ,其结铃性和纤维比强度明显高于转化受体冀合 32 1,这些纯合系可直接用于生产或作为双抗虫棉种质利用。

早熟棉体细胞胚胎发生和植株再生体系的建立

以8个早熟或特早熟棉花为材料,通过不同激素组合(1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L KT;0.1 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L KT)诱导其愈伤组织,为早熟棉花的遗传转化以及基因功能研究奠定基础.结果表明,2种激素组合均能诱导产生4种主要类型的愈伤组织:淡黄色颗粒状愈伤组织,褐化的愈伤组织,翠绿致密的愈伤组织,疯长型愈伤组织.4种愈伤组织转入增殖培养基中前2种愈伤组织能够分化出胚性愈伤组织,胚性愈伤组织再转到分化培养基上培养能够产生胚状体,即体细胞胚;体细胞胚进一步发育成为再生小苗.用该组织培养再生系统,成功地使晋棉5号、中棉27号和辽棉10号等3个早熟棉品种在5～7个月内通过体细胞胚胎分化获得再生小苗.

转Cry1Ac活性杀虫蛋白及慈菇蛋白酶抑制剂B基因的棉花(英文)

根据植物基因的结构特征,合成了CrylAc活性杀虫蛋白的编码序列并与内质网定位肽编码序列组成嵌合杀虫蛋白基因Bt29K。构建了含Bt29K基因及慈菇蛋白酶抑制剂B(API-B)基因表达框的双抗虫基因植物表达载体。通过根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens (Smith et Townsend )Conn LBA4404)介导转化了棉花(Gossypium hirsu-tum L.)的两个生产品种(系)。根据抗棉铃虫(Heliothis armigera )试验及农艺性状的观察调查结果,经6代筛选,获得了抗棉铃虫90.0％-99.7％且农艺性状优良的9个双价抗虫棉纯合品系。分子生物学分析结果表明,两个抗虫基因在棉花基因组中的插入拷贝数为1个或2个。活性CrylAc和API-B蛋白在转基因抗虫棉株系中的表达量分别约占总可溶性蛋白的0.17％和0.09％。对双抗纯合系植株及仅转Bt基因的棉花纯合系抗虫性检测结果表明前者的抗虫性明显高于后者,因此推断本研究采用的双抗虫基因表达载体构建策略是合理的。

南瓜韧皮部特异性启动子在转基因棉花中的表达

以自行构建的重组南瓜韧皮部特异启动子dENP构建了植物表达载体pBII2。利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA44O4介导转化棉花(Gossypium hirsutum L.)品种珂字312,共获得转pBII2和对照pBI121的抗卡那霉素棉花再生植株243株,筛选出172株为转基因阳性植株。Southern blot分析确证外源Gus基因插入拷贝数在1个或2个以上。对这些转基因棉花植株进行Gus染色结果表明dENP和CaMV35S启动子一样均能驱动Gus基因的表达,前者仅在棉花的韧皮部内特异表达,而CaMV35S启动子驱动的Gus基因为组成性表达。Gus酶活力测定结果进一步表明dENP和CaMV35S启动子驱动Gus基因表达水平相当,但是转pBII2棉花植株的Gus富集在韧皮部组织。证明了dENP启动子驱动的外源基因在棉花中具有韧皮部特异而高效表达的特征,从而可用于棉花抗病、抗蚜虫转基因研究。

转Bt基因棉花的研究应用及问题与对策

20世纪80年代初Bt毒蛋白基因被克隆并转化到植物当中,转Bt基因棉花的应用已取得了相当的效益。但随着转Bt基因棉花的种植,也出现了许多问题,诸如抗药性的产生、抗虫谱狭窄、表达水平低等。现在转抗虫基因棉花的研究主要围绕着转多基因抗虫棉的培育,采用特异启动子调控外源抗虫基因在棉株体内的高效表达,修饰Bt基因以改善Bt毒蛋白的杀虫效能,重视外源与内源抗虫系统间的协调性,加强现代基因工程与传统抗虫育种相结合和筛选广谱性抗虫基因培育广谱性抗虫棉花,等等。

Bacillus thuringiensis营养期杀虫蛋白Vip3与其转基因植物研究进展

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前应用最多的生物杀虫剂。它能够产生多种杀虫因子,其中,最主要的是杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)和营养期杀虫蛋白(Vegetative insectici-dal protein,Vip)。当前,大部分商业化利用的转基因作物均为杀虫晶体蛋白类,随着这些转基因作物种植面积的扩大,害虫对这些较为单一的杀虫蛋白产生抗性已成为一个严峻的问题。Vip3是Vip杀虫蛋白中的一类,不形成蛋白晶体,和ICPs在进化上没有同源性;其对鳞翅目、鞘翅目和同翅目等害虫具有毒杀作用,抗虫谱较广。目前,已经把Vip3基因导入了水稻、玉米和棉花等多种作物中,为作物抗虫育种、延缓害虫产生抗性和减少作物产量损失等带来新的前景。

棉花抗逆基因GhAREB4的克隆及功能分析

AREBs转录因子家族基因主要参与干旱、高盐、低温等胁迫应答反应,在植物抵御各种逆境胁迫中起着非常重要的作用。该研究经序列电子拼接克隆了陆地棉GhAREB4基因,该基因全长1 784bp,其开放阅读框为1 227bp,编码408个氨基酸,预测分子量为44.3kD,等电点为8.88。蛋白结构预测发现,该蛋白二级结构中含有bZIP基因家族的保守结构域。系统进化树分析表明,GhAREB4与可可的AREB转录因子同源性最高。绿色荧光蛋白亚细胞定位分析表明,GhAREB4蛋白分布在细胞核内。qRT-PCR分析表明,GhAREB4基因在花中的表达量最高;且GhAREB4基因表达受到干旱、高盐、低温、脱落酸(ABA)等处理的诱导,其可能调控棉花对非生物逆境的耐性响应。研究结果为进一步研究该基因对棉花耐逆调控机制奠定了基础。

不同继代时间调控棉花愈伤组织褐化死亡和植株再生效率的研究

棉花组织培养中愈伤组织褐化常常严重影响植株再生的效率,如何解决棉花组织培养过程中愈伤组织和胚性愈伤组织首次继代的两次褐化死亡高峰,是关系到是否能够大幅度提高棉花植株再生和遗传转化效率的关键因素之一。本研究分析了冀合713和珂字312两品种愈伤组织的继代时间与褐化死亡程度、植株再生时间和再生率,结果表明继代时间对棉花愈伤组织两次褐化死亡高峰存在着显著调控作用。在第一次高峰发生时延长继代时间间隔到50d,可以显著降低愈伤组织继续褐化死亡,提高胚性愈伤组织的发生率和缩短胚胎发生时间。在第二次高峰发生时缩短继代时间间隔为15d,可以显著降低愈伤组织褐化死亡程度,从而增加植株再生率和缩短植株再生时间。通过继代时间间隔的调控,有助于提高两个棉花品种的转化效率,为棉花基因功能验证和功能基因组研究提供了保证。

亲环素基因GhCYP1在陆地棉中的过量表达及耐盐性分析

通过农杆菌介导法将亲环素基因GhCYP1导入陆地棉棉花栽培品种中棉35中,经过卡那霉素抗性选择、PCR检测和系统选育获得5个不同转基因纯合系.在温室盆栽条件下,于3片真叶期对转基因棉花纯合系和非转基因对照进行200 mmol/L NaCl胁迫处理20d.结果表明,转GhCYP1基因棉花株系比对照长势强,株高比对照提高2～5cm,地上部分单株鲜质量比对照增加7.1％～12.4％,抗氧化物酶SOD,POD,CAT等的活性以及叶绿素含量显著高于对照.说明过量表达GhCYP1基因提高了陆地棉对盐碱的抗性.

9个抗虫棉品系的杂种优势及其产量性状配合力分析

为了分析转Bt基因棉花蛋白高表达品系的杂种优势和配合力,采用NCⅡ设计,利用4个生产上推广应用的棉花品种与9个转Bt基因棉花蛋白高表达品系进行杂交组配,对36个组合的F1产量性状的杂种优势和配合力进行分析。结果表明:大多数组合的竞争优势明显,皮棉和籽棉的产量均具有较大的竞争优势,两者分别为16.1%和6.8%,皮棉和籽棉的产量的竞争优势率分别达到83.3%和80.6%。产量性状的优势大小依次为衣分、铃重和单株铃数,分别为3.7%、2.0%和0.8%。对组合的配合力方差进行分析,结果显示:9个转基因抗虫棉品系各产量性状的一般配合力差异较大,对这些组合特殊配合力进行分析,发现有3个组合具有较高的特殊配合力。

山西省转Bt基因抗虫棉花品种抗虫性监测

采用ELISA检测和室内抗虫性测定方法相结合,2013年对山西省南部种植的6个转Bt基因抗虫棉花品种的不同生育期叶片Bt杀虫蛋白的表达量及对棉铃虫的抗性进行分析。结果表明,6个品种Bt杀虫蛋白的叶片表达量在苗期最高,然后从现蕾、开花、结铃直到吐絮逐渐下降。室内喂虫试验结果表明,6个品种对第2代棉铃虫达到高抗或中抗的水平,抗虫指数变幅为72.2%~95.5%;然而对第3,4代棉铃虫的抗性较低,仅为20.2%~65.2%。其中,DR3、晋棉38、晋棉50、中棉41抗性较好,而中棉43和DR5抗性较差。总之,在山西省棉区的抗虫棉品种的抗虫性存在明显的差异,建议剔除抗虫性低的品种,从而保证该地区抗虫棉花的持久种植。

Gelrite的浓度对棉花愈伤组织胚分化的影响

在棉花胚性愈伤组织向胚分化时，固化剂Ｇｅｌｒｉｔｅ的浓度增加为３．０ｇ·Ｌ－１时，胚分化率大幅度的提高，胚颜色洁白，生命力旺盛，畸形胚率下降。

棉花人工突变体的研究进展及其利用展望

棉花突变体的创造是棉花功能基因组研究的基础。对棉花突变体来源、种类及研究进展进行了总结和评述,提出了未来棉花突变体发掘和创制的方法;并针对棉花突变体研究所面临的问题进行分析,对其利用前景进行了展望。

pH值对培养基颜色的影响研究

附加３０ｇ·Ｌ－ １葡萄糖的ＭＳ培养基中，当ｐＨ值大于６５ 时，高温高压灭菌时会发生颜色反应。当ｐＨ值６８ 时，颜色有质的变化。一般情况下灭菌的时间和压力对培养基颜色没有影响。

转双抗虫棉纯合系的杂种优势及其产量性状的配合力

采用NCII设计,利用4个生产上推广应用的棉花品种与9个转两类抗虫基因(Cry1Ac和API)纯合系进行杂交组配,对36个组合的F1产量性状的杂种优势和配合力进行分析,结果表明:大多数组合的竞争优势明显,各产量性状均具有竞争优势,但子指的优势为负值;皮棉和子棉的产量均具有较大的竞争优势,两者分别为17.2%和7.9%,皮棉和子棉产量的竞争优势率分别达到86.1%和80.6%。产量性状的优势大小依次为衣分、铃重和单株铃数,分别为4.1%,2.1%和0.7%。对组合的配合力方差进行分析,结果显示:9个转基因抗虫棉纯合系各产量性状的一般配合力差异较大,4个母本中的两抗虫棉的皮棉和子棉的产量的一般配合力优于两非抗虫棉。对这些组合特殊配合力进行分析,发现有6个组合具有较高的特殊配合力。因这9个纯合系的受体均为冀合321,所以这种配合力的差异是由外源基因作用的差异造成。

转GHABF4转录因子棉花植株的耐盐性研究

AREB/ABFs转录因子家族基因主要参与干旱、高盐、低温等胁迫应答反应。为了获得具有较高耐盐水平的棉花新种质材料,通过农杆菌介导法将耐盐转录因子基因(GHABF4)导入陆地棉中棉35中,通过对转化植株的卡那霉素初步筛选及T1、T2、T3目的基因PCR的分子检测,获得T3转基因棉花纯合系。通过盐胁迫试验对5个T3转基因棉花株系和非转基因棉花对照进行耐盐性分析。结果表明,在200 mmol/L Na Cl胁迫下,与非转基因对照相比,5个转基因棉花株系株高提高2.5~4.4 cm,地上部分的鲜质量增加3.6%~11.8%;且抗氧化物酶SOD、POD、CAT活性以及叶绿素含量提高。在盐胁迫条件下,转GHABF4基因棉花表现出优良的生长和生理优势,转GHABF4基因能够提高棉花的抗盐能力。