外源性H_(2)S对血管性痴呆大鼠缺血再灌注后神经元线粒体损伤及其相关信号通路的影响

目的以二血管(2-VO)法制作血管性痴呆(VaD)大鼠模型,探讨神经元自噬及相关信号通路的变化及外源性硫化氢(H_(2)S)的神经保护作用。方法改良2-VO结扎SD大鼠双侧颈总动脉制作VaD模型,按缺血进程急性缺血期、缺血损伤期、损伤恢复期共设置1、7、30 d 3个时间段,每个时间段各有假手术(Sham)组、模型(VaD)组、阳性对照[尼莫地平(Nimodipine)组、硫氢化钠(NaSH)低剂量(Low-NaSH)组、NaSH高剂量(High-NaSH)组。为保持药物处理时间一致,1 d及7 d,各组术前灌胃给药30 d,30 d各组术后灌胃给药30 d,VaD组和Sham组生理盐水灌胃,Nimodipine组Nimodipine灌胃给药,Low-NaSH组、High-NaSH组NaSH灌胃给药。利用水迷宫检测30 d各组学习记忆能力。Western印迹检测海马神经元线粒体蛋白中Beclin1、P62、蛋白激酶B(Akt)、P-Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、P-mTOR表达。结果术后1 d,与Sham组比较,VaD组Beclin1、P-Akt、P-mTOR表达显著降低;与VaD组比较,不同剂量NaSH组Beclin1表达显著降低,Nimodipine组及不同剂量NaSH组P-Akt表达显著降低(P<0.01,P<0.05)。术后7 d,与Sham组比较,VaD组P62、P-Akt、P-mTOR表达显著降低,Beclin1表达显著升高;与VaD组比较,Nimodipine组及不同剂量NaSH组P62表达显著升高、Beclin1表达显著降低,不同剂量NaSH组P-Akt表达显著升高,High-NaSH组P-mTOR表达显著升高(P<0.05,P<0.01)。术后30 d,与Sham组比较,VaD组Beclin1、P62表达显著升高,P-mTOR、P-Akt表达显著降低;与VaD组比较,Nimodipine组及不同剂量NaSH组Beclin1、P62表达显著降低,P-mTOR、P-Akt表达显著升高;与Low-NaSH组比较,High-NaSH组Beclin1、P62表达显著降低,P-mTOR、P-Akt表达显著升高(P<0.05,P<0.01)。结论缺血再灌注会导致神经细胞线粒体功能受损,且引发线粒体自噬,外源性H_(2)S可减轻VaD大鼠海马神经元线粒体自噬程度并保护线粒体功能,从而改善VaD大鼠学习记忆功能,推测其保护作用是通过上调磷脂酰肌醇3蛋白激酶(PI3K)/Akt/mTOR信号通路实现的。

加大水资源管理力度 实现水资源的可持续利用

随着我国经济迅速发展和水资源开发活动的大力开展,水资源保护压力越来越大,水环境的破坏与社会经济进一步发展的矛盾日益凸显。水资源问题成为目前我国最受关注的问题之一,然而由于在水资源管理上的不足导致了原本稀缺的水资源被大量浪费掉。从水资源全面有效管理、法规制度等方面指出了我国在水资源管理中存在的问题,并介绍了国外先进的水资源管理方式和管理经验,提出了适合我国国情的解决水资源问题的途径。

外源性H_2S对血管性痴呆大鼠海马MDA、SOD、Cyt C表达的影响

目的:探讨外源性硫化氢(H_2S)对血管性痴呆大鼠(VaD)学习记忆能力、脑组织中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及神经元细胞色素C(Cyt C)表达的影响。方法:60只成年健康雄性SD大鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(VaD)、阳性对照组(Nimodipine)、NaSH低剂量组(Low-NaSH)及NaSH高剂量组(High-NaSH),除假手术组(仅分离双侧颈总动脉但不结扎)外,其余4组大鼠采用改良二血管法复制大鼠VaD模型,造模后阳性对照组给予尼莫地平10 mg/(kg·d)灌胃给药,NaSH低、高剂量组分别给予30μmoL/(kg·d)、100μmoL/(kg·d) NaSH灌胃给药,模型组及假手术组均给予等量生理盐水灌胃;给药30 d时,采用Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力,水迷宫测试结束后采用BCA蛋白定量法测定样本蛋白浓度记为C_(样本),结合标准曲线计算组织中MDA含量;用BCA法测定样本蛋白浓度C_(样本),计算组织中SOD活力单位;Western blot法检测海马胞浆Cyt C表达。结果:与Sham组比较,VaD组大鼠的学习记忆能力显著下降,神经元胞浆蛋白中Cyt C表达显著升高,脑组织中MDA含量显著增多、SOD活性显著升高(P<0.01);与VaD组大鼠比较,加NaSH处理后,大鼠学习记忆能力显著提高,神经元胞浆蛋白中Cyt C表达显著降低、脑组织中MDA含量及SOD活性均显著降低(P<0.01),与阳性对照组结果相近。结论:NaSH可改善VaD大鼠的学习记忆能力,其机制可能与NaSH降低大鼠海马的氧化应激水平、保护神经元细胞中线粒体功能有关。

外源性H_(2)S对氧糖剥夺再灌注后SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

目的探讨外源性硫化氢(H_(2)S)对氧糖剥夺再灌注(OGD/R)后SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。方法建立SH-SY5Y细胞OGD/R模型,SH-SY5Y细胞分为对照组、OGD/R模型组、OGD/R+不同浓度NaHS(H_(2)S供体)处理组;OGD/R制备:用不含血清的低糖DMEM培养基在37℃、930 mL/L N_(2)、20 mL/L O_(2)的低氧条件下培养各组细胞12 h,然后用完全培养液复氧培养24 h。采用CCK-8检测存活率,流式细胞技术检测细胞凋亡水平,蛋白印迹方法(Western blotting)检测细胞中内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)及NF-κBP65、COX-2蛋白表达水平。结果OGD/R模型组SH-SY5Y细胞活性较对照组降低(P<0.05)。0~0.5 mmol/L浓度的NaHS处理组细胞活性随着给予NaHS浓度的增加较OGD/R模型组逐渐升高(P<0.05),超过这个浓度范围,细胞活性较OGD/R模型组降低(P<0.05)。模型组细胞的早期凋亡水平均显著高于对照组(P<0.05)。0.2、0.4 mmol/L NaHS处理组细胞的早期凋亡水平较OGD/R模型组显著降低、4 mmol/L NaHS处理组细胞的早期凋亡水平较OGD/R模型组显著升高(P<0.05);Western blotting检测结果显示,OGD/R模型组细胞的GRP78、CHOP、NF-κBp65及COX-2蛋白表达水平均显著高于对照组(P<0.05);与OGD/R模型组比较,0.2、0.4、4 mmol/L浓度NaHS处理组细胞的GRP78、CHOP、NF-κBp65及COX-2表达水平显著降低(P<0.05),但各剂量组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论NaHS可以提高经OGD/R损伤后细胞的活性,可能是通过抑制内质网应激诱导的NF-κBp65、COX-2蛋白的激活从而减少细胞凋亡水平来实现。

2017-2019年贵州省结核分枝杆菌多位点序列分析及与耐药的相关性

目的了解贵州省2017-2019年结核分枝杆菌分离株的等位基因型别特征及其与耐药的相关性,为贵州省结核病的防治提供科学依据。方法收集贵州省毕节市、安顺市、仁怀市和威宁县4个国家级结核病耐药监测点2017-2019年分离的52株结核分枝杆菌,采用基于7个管家基因位点(recX、rpsl、rmlC、rpmG1、mprA、gcvH、ideR)的MLSA技术进行ST分型。选用异烟肼(INH)、链霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)、利福平(RFP)、卡那霉素(KAM)和氧氟沙星(OFX)6种抗结核药物对52株结核分枝杆菌进行药敏试验,分析菌株耐药与ST型别的相关性。结果52株结核分枝杆菌经MLSA分为11个ST型,其中优势ST型为ST11型(占32.7%)、ST1(占23.1%)和ST5型(占15.4%)。药敏试验显示,52株结核分枝杆菌总耐药率为42.3%(22/52),其中单耐药率为15.4%(8/52),耐多药率为19.2%(10/52),多耐药率为3.8%(2/52)。基于7个管家基因位点的聚类分析和最小间距图分析结果显示,ST2、ST4和ST6型菌株全部为敏感菌株,ST7和ST8型菌株均为多耐药菌株,ST9型菌株均为耐多药菌株,其余ST型由耐药和敏感菌株构成。结论贵州省2017-2019年结核分枝杆菌以ST11、ST1和ST5型为主,ST型呈现多样性。菌株以单耐药和耐多药为主,ST型与耐药具有一定的相关性。

结核分枝杆菌双靶标环介导恒温扩增检测方法的建立与应用

目的建立基于双靶标环介导恒温扩增(LAMP)的结核分枝杆菌(MTB)检测技术并应用于临床。方法以结核分枝杆菌复合群(MTBC)插入序列IS6110和MTB mtp40基因为检测靶标,分别设计1套LAMP引物。通过引物浓度和反应条件优化,建立基于双靶标的检测方法(mtp40-LAMP和IS6110-LAMP),比较2种方法的灵敏度和特异性。应用建立的mtp40-LAMP和IS6110-LAMP方法与PCR、萋-尼氏抗酸染色法和分枝杆菌分离培养法,分别对55例患者的痰标本进行检测与鉴定,通过对其结果的比较分析评价mtp40-LAMP和IS6110-LAMP方法的实用性。结果灵敏度试验显示,mtp40-LAMP和IS6110-LAMP方法可检出MTB基因组DNA最低浓度为125fg/μl,比常规的PCR方法高10~100倍。mtp40-LAMP和IS6110-LAMP方法的特异性为100%,能检测MTB菌株并能从MTBC中鉴别MTB。痰标本检测显示,IS6110-LAMP与PNB鉴定结果一致性检验的Kappa值为0.881(P<0.01),mtp40-LAMP与TCH鉴定结果的Kappa值为0.887(P<0.01)。与PCR方法和萋-尼氏抗酸染色法检测结果比较,mtp40-LAMP和IS6110-LAMP方法敏感性更高。反应体系中加入MG指示剂可直接通过肉眼观察颜色变化进行结果判定,实现了快速闭管检测。从样本处理(35min)、扩增反应(40min)到结果验证(1~2min),整个检测过程80min内即可完成。结论基于LAMP技术建立的mtp40-LAMP和IS6110-LAMP双靶标检测方法敏感性高、特异性强,能够快速、准确地检测和鉴别MTB,可作为潜在的MTB快速筛查或诊断工具。

Caspase-11非经典炎症小体对问号钩端螺旋体诱导J774A.1细胞炎性细胞因子分泌水平的影响

目的:了解caspase-11非经典炎症小体对问号钩端螺旋体(钩体)诱导J774A.1细胞分泌炎性细胞因子的影响。方法:采用钩体56601株感染小鼠单核-巨噬细胞株(J774A.1)建立细胞模型,应用real-time RT-PCR检测J774A.1细胞caspase-11、IL-1β、IL-1α和IL-18 mRNA水平,采用ELISA定量检测J774A.1细胞上清液中caspase-11、IL-1β、IL-1α和IL-18水平。结果:Real-time RT-PCR检测结果显示,钩体感染J774A.1细胞1、2、4、8、12和24 h后,caspase-11 mRNA水平分别为未感染细胞的5.12、14.21、8.94、14.06、18.58和0.93倍,caspase-11阻断后分别下降至0.10、0.07、0.10、0.09、0.07和0.45倍( P<0.05);钩体感染后,IL-1β、IL-1α和IL-18 mRNA水平均显著上调,caspase-11阻断后IL-1β mRNA水平分别下降至0.05、0.03、0.02、0.05、0.06和0.02倍( P<0.05);IL-1α mRNA分别下降至0.14、0.07、0.15、0.10、0.03和0.06倍( P<0.05);IL-18 mRNA分别下降至0.08、0.10、0.16、0.18、0.10和0.07倍( P<0.05)。ELISA检测结果显示,钩体感染J774A.1细胞后细胞上清液中caspase-11、IL-1β、IL-1α和IL-18水平均显著上调,caspase-11阻断后caspase-11分别下降至43.07、41.64、51.96、86.56、105.36和129.95 pg/ml( P<0.05);IL-1β分别下降至15.01、14.19、68.02、31.20、173.13和104.98 pg/ml( P<0.05);IL-1α分别下降至12.14、15.40、38.01、21.97、24.48和27.09 pg/ml( P<0.05);IL-18分别下降至96.27、102.21、85.34、116.28、155.36和114.03 pg/ml( P<0.05)。 结论:Caspase-11非经典炎症小体参与介导问号钩体诱导小鼠单核-巨噬细胞IL-1β、IL-1α和IL-18的分泌。

贵州省两个结核病监测点RFP和INH耐药基因检测与分析

目的应用分子生物学技术对贵州省威宁县和仁怀市2个结核病省级耐药监测点2018年确诊结核病患者感染结核分枝杆菌(MTB)RFP和INH耐药基因进行检测与分析,为结核病的防治提供参考数据。方法采用半巢式全自动实时荧光定量PCR结合PCR-线性杂交酶显色法对威宁县和仁怀市97例确诊结核病患者的痰培养物进行MTB核酸及利福平(RFP)和异烟肼(INH)耐药基因检测,分析结核病患者性别年龄构成。结果威宁县52份痰培养物样品经半巢式全自动实时荧光定量PCR检测出MTB核酸阳性49份,阳性率94.23%,RFP耐药基因阳性3份,RFP耐药率为6.12%。对RFP耐药基因阳性标本进行菌株分离培养和PCR-线性杂交酶显色检测,结果显示其中1株为RFP和INH双重耐药,双重耐药率为2.04%;仁怀市45份样品经半巢式全自动实时荧光定量PCR检测出MTB核酸阳性33份,阳性率73.33%。对RFP耐药基因阳性的2份标本进行菌株分离培养和PCR-线性杂交酶显色检测,结果显示RFP和INH耐药基因均阳性,双重耐药率为6.06%。患者性别构成分析结果显示,威宁县结核病患者男女比例为1.9∶1,仁怀市为1.6∶1,均为男多于女。患者年龄段分析显示,以青年及中年(18-65岁)多见,威宁县占86.53%(45/52),仁怀市占75.56%(34/45)。结论威宁县结核病患者感染MTB RFP耐药率6.12%,RFP和INH双重耐药率为2.04%;仁怀市结核病患者感染MTB RFP耐药率为6.06%,RFP和INH双重耐药率为6.06%。两地患者中均呈现男多于女,且以青年及中年占多数,结果可为当地结核病的防治提供参考依据。

Caspase-4非经典炎症小体对问号钩体诱导THP-1细胞炎症因子分泌水平的影响

目的了解Caspase-4非经典炎症小体在问号钩体诱导THP-1细胞炎性细胞因子分泌过程中的作用。方法采用问号钩体感染THP-1细胞(预先经佛波酯刺激分化为巨噬细胞)建立细胞模型,用实时荧光PCR扩增检测caspase-4、IL-18、IL-1β和IL-1αmRNA水平,Western blotting检测Caspase-4蛋白表达,ELISA定量检测细胞上清中IL-18、IL-1β和IL-1α分泌情况。结果实时荧光PCR和Western blotting显示,与未感染细胞比较,THP-1细胞Caspase-4 mRNA及蛋白表达水平均升高(t=46.03、29.36,均P<0.05),Caspase-4 siRNA转染后,Caspase-4 mRNA及蛋白表达水平显著下降(t=32.48、30.77,均P<0.01);钩体感染后,IL-18、IL-1β和IL-1αmRNA水平显著升高(t=25.70、26.13、19.94,均P<0.05),在Caspase-4特异性阻断后显著下降(t=11.55、44.68、15.68,均P<0.05);ELISA检测显示,钩体感染后,IL-18、IL-1β和IL-1α分泌均显著升高(t=50.24、34.17、25.18,均P<0.05),且能被Caspase-4特异性阻断剂有效抑制(t=42.00、17.07、5.03,均P<0.05)。结论Caspase-4非经典炎症小体参与介导问号钩体诱导人单核-巨噬细胞炎性细胞因子IL-18、IL-1β和IL-1α的分泌。