甜菜夜蛾增殖马尾松毛虫质型多角体病毒研究

以甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)作为替代宿主增殖马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)的研究结果表明,DpCPV在甜菜夜蛾体内连续传代3次后得到的DpCPV-Se3与DpCPV具有相同的电泳图谱;多角体和病毒粒子在电镜下观察,未发现形态上的明显变化.生测结果表明,DpCPV-Se3与DpCPV回接松毛虫试验,其半数致死浓度分别为0.92×103 PIB/mL和1.44×103PIB/mL,二者毒力差异不显著.以甜菜夜蛾增殖DpCPV,多角体产量达到2.34×108PIB/头.用DpCPV-Se3和DpCPV的S7和S10片段分别进行同源性序列分析,结果没有明显变化.认为利用甜菜夜蛾增殖DpCPV用于生物防治具有可行性.

甜菜夜蛾室内人工饲养技术方法的建立

随着生物农药的不断发展,许多昆虫也逐步加入到实验动物行列中,甜菜夜蛾在农业及生命科学相关领域的研究中作为科研材料发挥着重要的作用。利用合理的人工配方饲料,通过室内长期的继代饲养繁育,确定了甜菜夜蛾生活史中各个阶段温度、湿度和光照等技术参数,掌握了甜菜夜蛾室内人工饲养管理的关键技术,从而建立了适宜甜菜夜蛾生长发育以及连续传代繁育的环境设施条件和技术方法。目前,甜菜夜蛾已经在室内连续传代超过100代,其产卵率、孵化率、幼虫成活率、化蛹率和蛹质量以及成虫羽化率等都一直处于稳定状态,种群未出现退化现象。

海榄雌瘤斑螟的生物学特性及Bt对其幼虫的毒力和防效

海榄雌瘤斑螟（Acrobasis sp．）是危害马鞭草科澳洲海榄雌（Avicennia marina var．austrasica）的主要害虫．在深圳红树林一年发生6—7代，每个世代25—32d，其中幼虫历期13—16d，蛹5～6d，成虫7～10d，卵3—5d．幼虫剥食海榄雌的叶肉，8月低龄幼虫蛀食嫩芽及种子，10月低龄幼虫开始在嫩芽内越冬，翌年3月上中旬，越冬幼虫开始活动．每年4月下旬至6月中旬爆发的第2代和第3代密度较大，造成海榄雌大面积危害．在室内，用Bt感染2龄海榄雌瘤斑螟，致死浓度（C）-死亡几率值（Y）测定的回归线为Y=4．66＋1．78C，80％的致死浓度LC80为4．60IU／mL；致死时间（T）-死亡几率值（Y）测定的回归线为Y=4．305T-1．51，80％的致死时间LT80为50．86h．在林间，用8—10IU／mL的Bt稀释液喷雾对海榄雌瘤斑螟进行防治实验，平均防效为90．61％．

刚果红对棉铃虫中肠围食膜的影响及其病毒增效作用

通过观察棉铃虫幼虫正常围食膜(peritrophicmembrane,PM)的形态、结构和组成,研究了刚果红对棉铃虫幼虫围食膜的破坏作用及其对棉铃虫核多角体病毒(HaNPV)的增效作用。结果表明,棉铃虫的围食膜分布于整个中肠,包裹着食物呈液囊状,类似于Ⅰ型围食膜;健康的围食膜呈无色、透明网状结构,并具有一定韧性,经刚果红染色后呈现桔红色。使用不同浓度梯度的刚果红喂食5龄幼虫,结果显示摄取含1.5%和2.0%刚果红的饲料2.5h后,宿主不能形成完整的围食膜,而是形成易脆无弹性的围食膜碎片。经过恢复实验后发现,刚果红对围食膜的破坏作用是瞬时的,可以在较短时间内得到修复。用1.0%刚果红喂食初孵幼虫,发现1.0%刚果红对棉铃虫的幼虫生长不能产生明显的影响。1.0%刚果红能加强棉铃虫幼虫对HaNPV的敏感性,缩短病毒杀虫时间,能使5龄幼虫的病毒感染致死率达到63%,对HaNPV具有非常显著的增效作用。

马尾松毛虫质多角体病毒NS5蛋白的表达和功能初步分析

马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株第9个片段编码非结构蛋白NS5,利用pET-32a(+)载体带有组氨酸标记的重组蛋白进行表达,获得纯化的重组蛋白。利用凝胶电泳阻滞检测试验(EMSA)检测蛋白和核酸的结合作用,结果表明NS5蛋白能与病毒基因组dsRNA结合。

实验棉铃虫携带微生物的检测

目的通过对本所长期室内人工饲育的不同季节不同龄期的棉铃虫（Heliothis armigera）进行体内外的微生物分离培养和鉴定，掌握棉铃虫体内外微生物携带情况。方法利用普通培养基和真菌培养基分别对棉铃虫体内外进行微生物分离培养、纯化，通过菌落形态观察、革兰氏染色和显微镜观察进行初步鉴定，然后应用16SrRNA和18SrDNA分析技术对分离的细菌和真菌进行进一步的鉴定。同时，利用PCR技术对棉铃虫的高度致病病毒-核型多角体病毒（HaNPV）进行扩增检测。结果分离培养得到4株芽孢杆菌（Bacillus）：分别为枯草芽孢杆菌（Bacilluss ubtilis Cohn），地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）和芽孢杆菌（Bacillus）。4株真菌（fungi）：其中2株为酵母菌（Yeasts），1株为青霉菌（Aenicil lium Link），1株为曲霉菌（Aspergillus Micheli）。检测核型多角体病毒（HaNPV）为阴性。结论室内人工饲养的棉铃虫生长状态良好，虫体健康，未携带致病微生物，为科研提供的实验昆虫质量稳定可靠。

影响DpCPV杀虫剂高产条件的研究

DpCPV杀虫剂的产量不仅受到气候、环境等因素的影响,而且严重受到生产工艺技术水平的制约.针对DpCPV杀虫剂生产过程中工艺技术问题,我们对马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株在室内、室外和林间大量增殖中的集虫虫质、接种浓度、频率、收获时间等及其相互间的关系进行了详细研究,得出在DpCPV杀虫剂生产过程中接种1×107CPB/mL病毒浓度为宜,接种虫龄以4～5龄虫为宜,收获病毒时间13～14d为宜.其室外单虫病毒产量平均可达到7.5×108CPB,比国内报道要高.研究结果对DpCPV杀虫剂的高产增殖有很强的指导意义.

分月扇舟蛾颗粒体病毒的形态和限制性内切酶图谱分析

将从自然罹死的分月扇舟蛾Closteraanastomosis (L .)幼虫中分离到的一种颗粒体病毒 (简称CaL GV)置于电子显微镜下观察 ,其形态为椭圆形 ,大小为 (30 4 .5 3× 139.0 9)nm ;经碱解病毒粒子为杆状 ,大小为(2 4 6 .2 1× 6 1.36 )nm ;经酚∶氯仿∶异戊醇 (2 5∶2 4∶1)抽提 ,氯仿∶异戊醇 (2 4∶1)洗涤 ,2倍体积无水乙醇沉淀 ,抽提的核酸经EcoRⅠ ,HindⅢ ,NcoⅠ ,PstⅠ限制型内切酶酶解 ,1×TAE缓冲液 ,0 .8%琼脂糖凝胶电泳 ,获得CaLGV核酸酶解图谱。以λDNA HindⅢ酶解片段在凝胶中的迁移率与相应片段分子量的对数值做标准曲线 ,求得CaLGV平均分子量为 10 0 .4 8kb ,核酸含量为OD2 60 /OD2 80 =1.89。

还原型谷胱甘肽在AG129小鼠生物净化及快速繁殖中的应用

目的AG129小鼠自然产仔困难,采用常规体外受精试剂无法获得足够数量用于移植的胚胎。使用还原型谷胱甘肽(GSH)调节小鼠体外受精液成分,完成对AG129小鼠体外受精,为体外受精困难品系的基因工程小鼠生物净化及快速扩繁提供思路。方法设计3个含不同浓度GSH的精子获能及受精液的实验组,浓度分别0.5、1、2 mmol/L,1个不含GSH的精子获能液及受精液的对照组,每组超排5只小鼠,重复3次。结果不同GSH实验组及对照组间平均受精率差异具有显著性(P<0.05),在精子获能及受精液中GSH浓度为1 mmol/L时,AG129小鼠体外受精效果最佳,平均受精率为(43.35±1.76)%,胚胎状态良好。将获得胚胎移植受体小鼠,受体动物均妊娠并顺利产仔。结论体外受精液中的GSH浓度为1 mmol/L时,能够显著提高AG129小鼠体外受精效率,为类似体外受精困难品系的小鼠生物净化及快速繁殖提供解决方案。

文山松毛虫质型多角体病毒S8片段cDNA克隆与原核表达

文山松毛虫质型多角体病毒(DpwCPV)S8 片段被克隆和测序,该片段全长 1332bp,编码 390 个氨基酸组成的分子量大约为 43kDa 的蛋白 P44。根据本实验室测定出的马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV )基因组全序列,设计引物,扩增出文山松毛虫质型多角体病毒 S8 部分片段,并亚克隆出 p44 基因序列,然后将 p44 基因序列 cDNA克隆到表达载体 pET-28a 中,构建成表达质粒 pET-S8,用 IPTG 诱导大肠杆菌 BL21,经 SDS-PAGE 证明 p44 基因在大肠杆菌中获得成功表达,并对其编码蛋白序列进行了分析。

Ⅰ型干扰素受体缺失小鼠体外受精实验研究

目的探索两种I型干扰素受体缺失对于小鼠体外受精的影响并对体外受精条件进行优化。方法对两种Ⅰ型干扰素受体缺失小鼠(IFN-αR^-/-、IFN-α/βR^-/-)及背景野生型小鼠(C57BL/6)分别进行体外受精及胚胎移植,每组超排5只小鼠,3次重复,记录相关数据,分析干扰素受体缺失是否对小鼠体外受精存在影响。分别将两种Ⅰ型干扰素受体缺失小鼠配子与C57BL/6小鼠配子进行体外受精杂交试验,每组5只小鼠,3次重复,探讨Ⅰ型干扰素受体缺失对雌雄配子体外受精的影响。同时,优化体外受精条件,探索提高受精率技术方法,每组5只小鼠,三次重复。结果两种Ⅰ型干扰素受体缺失小鼠平均体外受精率低于背景品系C57BL/6小鼠,组间差异具有显著性(P<0.05)。干扰素α受体缺失小鼠体外受精率高于干扰素α、β受体双缺失小鼠体外受精率,组间差异具有显著性(P<0.05)。两种Ⅰ型干扰素受体缺失小鼠的精子与C57BL/6小鼠卵细胞体外受精率均高于其卵细胞与C57BL/6小鼠精子的体外受精率,组间差异具有显著性(P<0.05)。通过延长精子获能时间至1 h或在获能液及受精液中加入1 mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)能够提高体外体外受精率,相应组间差异具有显著性(P<0.05)。结论 Ⅰ型干扰素受体缺失可能导致相应品系小鼠体外受精率降低,而且对卵细胞的影响较精子的影响更为显著,通过适当延长精子获能时间或改变获能及受精液成分,能够提高体外受精率。

直升机防治草原毛虫效果评价

草原毛虫为我国高原牧区的重要害虫,近年来在甘南高山草原为害严重。2017~2018年采用AS350B3e小松鼠直升机喷洒菜颗·苏云菌药液防治草原毛虫,以航速120 km/h、航高20 m作业,每架次用药65 kg,药液共400 kg,防治面积86.67 hm^(2)。作业15 d后,2年平均虫口致死率>95%,总体平均灭杀率>93%。结果表明,AS350B3e小松鼠直升机喷洒菜颗·苏云菌药液防治草原毛虫满足防治要求,可以在生产中推广应用。

无害化立体防控技术在茶园害虫防控中的应用

采用包括智能杀虫平台、生物导弹、苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)+枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、捕食螨和异色瓢虫等防控技术,对贵州省凤冈县田坝茶区300 hm2茶园开展主要害虫智能无害化立体防控试验。通过2年实地应用,统计防控区主要害虫消长数据发现,无害化立体防控技术能有效控制田坝茶区茶银尺蠖、茶毛虫、木橑尺蠖、茶卷叶蛾、茶小绿叶蝉、茶棍蓟马、黑刺粉虱等多种害虫的发生,减轻了害虫对茶树的为害。防控区茶叶产品农药残留分析表明,茶叶样品中的农药残留量符合欧盟新修订的农药残留最大限量标准(EC)No.396/2005要求。

新型夹竹桃天蛾质型多角体病毒的分离与初步鉴定

为了开发新型的夹竹桃天蛾的生物杀虫剂,本文从自然死亡的夹竹桃天蛾幼虫分离到病原微生物。通过电镜观察、FLAC(Full Length Amplification of cDNAs)技术以及病原体的基因组S2和S10片段的同源性分析,初步确认该病原体是一种质型多角体病毒(Daphnis nerii Cypovirus,DnCPV))。该病毒基因组电泳分析显示病毒基因组由10条dsRNA组成,大小在89 2bp和(约)4 160bp之间,其条带大小与现有的22类型均不相同。采用FLAC技术克隆了一种该CPV的基因组cDNA,并完成了基因组S2片段和S10片段序列测定工作。测序结果显示,DnCPV基因组S2片段编码RNA聚合酶,S10片段编码多角体蛋白。两者末端保守序列相同,正链5’端和3’端分别存在末端保守序列5’AGUCAAA·AGC3’。基于RNA聚合酶和多角体蛋白的氨基酸序列的系统发育分析显示该质型多角体病毒与19型和5型质型多角体病毒有较近的亲缘关系,但是电泳型上存在明显差异。因此推测该病毒是一种多角体病毒新类型,暂命名为夹竹桃质型多角体病毒南昌株(DnCPV-NC)。