凝血因子Ⅸ促凝活性测定方法的条件选择

凝血因子Ⅸ促凝活性测定方法的条件选择６１００８１中国医学科学院输血研究所肖小璞，丁卫，李和，于，钟峻王海龄（指导）人血浆凝血因子Ⅸ促凝活性（ＦⅨ：Ｃ）的测定在出凝血疾病的诊断中具有重要的意义。过去在我国不能普遍开展一期法ＦⅨ：Ｃ检测，主要是难以得到缺...

经S/D灭活病毒处理的高纯度凝血因子Ⅸ研制初探

凝血因子Ⅸ（ＦⅨ）制品是治疗乙型血友病的主要制剂，但一般方法制备的ＦⅨ浓缩物，如凝血酶原复合物（ＰＣＣ），因含有较多的其他凝血因子（凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ｘ以及蛋白Ｃ等），易导致血栓的形成。若制品未经有效病毒灭活，还可造成患者输用后感染病毒。这两种情况又因...

缺凝血因子Ⅸ血浆的质量考察

缺凝血因子Ⅸ血浆＊的质量考察６１００８１中国医学科学院中国协和医科大学输血研究所肖小璞于李和丁卫闻欣周宇赵建阳周红１王海龄过去我国不能普遍开展凝血因子Ⅸ促凝活性（ＦⅨ∶Ｃ）检测的主要原因是，从重症乙型血友病人体内采集血浆非常不易，故难以获得缺凝血因...

缺蛋白C血浆的研制

选择一种可识别有含Ca^(2+)或无Ca^(2+)条件下呈现不同构象蛋白C(Protein C,PC)的特异单克隆抗体(McAb),将其与Sepharose 4B凝胶偶联制成亲和层析柱。新鲜人血浆通过该柱时,仅PC被吸附,流出液即为缺蛋白C血浆(Protein C Deficient Plasma,PCDP)。经检测,PCDP内残余的PC<1％,其它凝血因子含量或活性基本未变。用含Ca^(2+)缓冲液清洗层析柱后(洗脱物Pc为另一重要产品),该柱可反复使用。

测定凝血因子Ⅷ促凝活性的实验条件优化

凝血因子Ⅷ（ＦⅧ）促凝活性（ＦⅧ∶Ｃ）测定是确诊甲型血友病的主要方法，也是ＦⅧ制品（如冷沉淀、中纯ＦⅧ等）研制、开发和质控不可缺少的手段之一。但ＦⅧ∶Ｃ测定是一个受多种因素影响的实验。笔者参考文献［１，２］的测定方法，并以凝血实验的温育曲线稳定性为指...

缺凝血因子Ⅸ血浆的质量考查

本文对用单克隆抗体免疫亲和层析法自制的缺凝血因子Ⅸ血浆(FⅨDP)的质量进行了较为全面的考查。连续三批生产的FⅨDP其凝血因子Ⅸ促凝活性水平(FⅨ:C)均【1％,其他凝血因子水平均在正常凝血所需水平之上,各项理化指标也达到《制造及检测规程》的要求,且批间差异小。

谈谈解决我国当前“血荒”的策略和措施

近期我国已有10多个城市遭遇临床用血严重短缺,即血站采血量无法满足临床用血需求导致的所谓＂血荒＂。北京、南京、昆明、成都、青岛等城市临床用血纷纷告急,医院许多手术因缺少血液保障,被迫推迟甚至取消,

改良凝胶吸附法制备的凝血酶原复合物

采用ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ５０和ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ凝胶从人血浆中吸附制备经Ｓ／Ｄ病毒灭活处理后的ＰＣＣ制品，ＤＥＡＥ洗脱液经Ｓ／Ｄ处理（０．３％磷酸三丁脂和１％Ｔｗｅｎ８０，６～８ｈ，２４℃）后，使所加入具有感染剂量（＞１０６）的标志病毒ＶＳＶ、Ｓｉｎｄｂｉｓ、ＨＩＶ均被有效灭活；ＰＣＣ制品中Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子的比活性（Ｕ／ｍｇ）分别为０．７９９±０．３４９、０．３４３±０．２５２、０．７４７±０．３４８、０．５８０±０．１９９（ｎ＝７），均比传统ＰＣＣ提高１．５～２．５倍（其中ＦⅨ∶Ｃ的比活性提高有显著性，ｔ＝３．１０５，Ｐ＜０．０１），同时也优于国内同类制品（ｔ＝２．３６０，Ｐ＜０．０５），对其杂蛋白（ＡＴ－Ⅲ、Ｆｎ、ＰＫＡ、Ｐｌｇ、ⅧＲ∶Ａｇ抗Ａ、抗Ｂ凝集素）的分析也反映出ＰＣＣ纯度有所提高。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＩＥ、ＣＩＥ电泳图谱及ＨＰＬＣ层析图谱证实上述结果，ＰＣＣ中ＴＮＢＰ残留量≤１０μｇ／ｍｌ，Ｔｗｅｅｎ８０残留量≤１００μｇ／ｍｌ，均在安全范围内。

人凝血因子Ⅷ几种冻干保护剂的比较

目的探讨不同冻干保护剂对人凝血因子Ⅷ(FⅧ)制品在冻干及干热(100℃,30min)过程中的作用。方法同批次人FⅧ样品在相同冻干条件及一定保护剂(0.3%甘氨酸、1.5%蔗糖、1.0%白蛋白)组成的基础上,改变甘氨酸、蔗糖、白蛋白、木糖醇和精氨酸5种冻干保护剂的含量或种类,组合成6组配方,对不同配方冻干及干热后FⅧ制品外观、复溶后澄清度及FⅧ活性等进行分析比较。结果Ⅰ组(3%甘氨酸):冻干和干热后制品成形最好,但复溶后均有少量絮状物;Ⅱ组(5%蔗糖):冻干和干热后制品均萎缩,冻干过程部分制品水份未抽干,冻干后澄清度较好,干热后部分有少量絮状物;Ⅲ组(2%白蛋白):冻干和干热后制品成形较好,但复溶后均有絮状物;Ⅳ组(5%木糖醇):冻干后制品萎缩,复溶后澄清度最好,干热后膨胀,复溶后有大量絮状物;Ⅴ组(1.2%精氨酸):冻干和干热后制品萎缩,但复溶后澄清度均较好;Ⅵ组(5%木糖醇+1.2%精氨酸):冻干后制品膨胀,复溶后澄清度较好,干热后进一步膨胀,复溶有大量絮状物。各组冻干后FⅧ活性≥9.3 IU/ml,回收率均较高(≥84.2%);干热后差别明显,其中Ⅲ组(2%白蛋白)FⅧ活性≥9.3 IU/ml,回收率最高(≥90.4%),而Ⅳ组(5%木糖醇)和Ⅵ组(5%木糖醇+1.2%精氨酸)FⅧ活性≤0.94 IU/ml,回收率极低(≤9.8%)。结论在冻干及干热过程中不同冻干保护剂作用差异较大,甘氨酸赋形作用较好,精氨酸对制品中蛋白稳定作用明显,白蛋白对FⅧ活性保护作用最佳;较高浓度的蔗糖不利于冻干过程中水份的去除,木糖醇不适于作为需100℃干热处理的人FⅧ冻干保护剂。

两种纤维蛋白原功能测定方法的比较

目的 用自制凝血酶试剂 ,对两种纤维蛋白原 (Fib)功能测定方法进行比较 ,以期选择适用的方法。方法 采用世界卫生组织 (WHO)、英国国家生物标准及控制研究所 (NIBSC)推荐的Jocobsson法和美国国家临床检验标准委员会 (NCCLS)推荐的VonClauss法 ,对正常参比血浆、临床血浆样本及溶血、黄疸和脂浊血浆进行Fib测定。结果 两种方法测定临床血浆样本Fib含量有一定差异 ,P<0 .0 5 (n=1 0 ) ,VonClauss法测定值高于Jocobs son法 ;方法间精确度测定 ,其CV为 7.5 8%和 2 .1 3% ,测定正常参比血浆的平均回收率为 95 .2 1 %和 98.70 % ,测定线性范围的相关系数 >0 .999(P <0 .0 1 ) ,测定干扰物质的影响度范围在± 6 .2 %。结论 用自制凝血酶试剂 ,两种方法均显示出较好的精确度、准确度、线性范围和抗干扰能力。鉴于VonClauss法操作更简便快速 ,适用于全自动或半自动凝血仪测定 ,可作为Fib水平的常规测定方法。

1例凝血因子Ⅺ缺乏症的基因突变研究

目的研究1例凝血因子Ⅺ(FⅪ)缺乏症患者的基因突变,揭示其分子发病机制。方法应用凝固时间法测定患者血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原含量(Fbg)、凝血因子Ⅷ促凝活性(FⅧ∶C)、凝血因子Ⅸ促凝活性(FⅨ∶C)、FⅪ促凝活性(FⅪ∶C)及凝血因子Ⅻ促凝活性(FⅫ∶C);采用聚合酶链式反应(PCR)扩增产物直接测序的方法对患者FⅪ基因进行直接检测,鉴别其中可能存在的基因变异。结果患者血浆中APTT、PT、TT、Fbg含量、FⅧ∶C、FⅨ∶C、FⅪ∶C及FⅫ:C分别为64.2s、12.8s、17.9s、3.8g/L、87.4%、71.2%、16.6%及80.2%,其FⅪ基因第13号外显子编码482位氨基酸的碱基发生杂合性的错义突变TGC→TGG(Cys482Trp)。结论 Cys482Trp的杂合突变可能是导致患者FⅪ缺乏的分子发病机制。

人α1-抗胰蛋白酶缺乏症的临床治疗及α1-PI规模化制备的进展

α1-抗胰蛋白酶（alpha-1-proteinase inhibitor,α1-PI或α1-antitrypsin,α1-AT）是由肝细胞合成的1种丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor,serpin）,它最重要的生理功能是在肺内抑制弹性蛋白酶的活性[1]。1963年,Laurell和Eriksson[2]报道了遗传性α1-PI缺乏及其与患者早年（30~40岁）发生肺气肿的关系。

正常凝血质控血浆质量考察

目的考察自制冻干正常凝血质控血浆的性能。方法测定连续3批自制血浆各凝血因子活性等指标,以考察制备工艺的稳定性与可靠性;以活化的部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)和pH为测定指标,评价正常凝血质控血浆的批内均一性和稳定性;同时以新鲜混合血浆为对照,将自制产品与进口试剂进行比较。结果连续3批自制血浆的APTT、PT、TT均在正常值范围内,pH值稳定,各凝血因子的活性均>0.80IU/ml。变异系数APTT为0.6%(n=20),PT为0.8%(n=20),TT为2.2%(n=20)。血浆复溶后,4℃冰箱和室温下放置,8 h内血浆的APTT、PT、TT及pH均保持了较好的稳定性,其中变化最大的APTT极差为2.26s。冻干血浆4℃及-20℃存放条件下,30个月内血浆的APTT、PT、TT及pH亦保持了较好的稳定性,其中变化最大的APTT极差为3.29s。以新鲜混合血浆为对照,自制的正常凝血质控血浆与新鲜混合血浆其APTT均值相差0.52s,TT均值相差1.0s,PT无明显差别;德国DADE BEHRING正常凝血质控血浆与新鲜混合血浆其APTT均值相差6.82s,TT均值相差3.2 s,PT无明显差别。结论自制的正常凝血质控血浆具有正常凝血特性,产品的稳定性和批内均一性良好,可满足作为凝血试验质控血浆的要求。

LD-PCR检测FⅧ基因XbaⅠ位点多态性及其在血友病A携带者诊断中的应用

目的建立高特异性的针对凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因内含子22中XbaⅠ多态性位点的连锁分析法,以用于血友病A家系携带者的诊断。方法采用长距离PCR(LD-PCR)方法,特异性地扩增FⅧ基因内含子22中的XbaⅠ位点所在区域,用限制性内切酶XbaⅠ酶切,对5个血友病A家系作家系连锁分析,并对其中可提供多态性信息的家系作携带者诊断。结果家系1中确诊女性携带者1名及1名正常女性成员;家系2中确诊1名女性携带者;而家系3、家系4和家系5该位点无法提供多态性信息。结论基于LD-PCR的FⅧ基因XbaⅠ位点连锁分析方法具有较高的准确性和可靠性,这对临床上诊断血友病A携带者具有积极的意义。

人凝血因子X单克隆抗体的研制及鉴定

目的 用于提取高纯度凝血因子X(FX)和制备缺乏FX血浆 ,以及建立FX抗原的ELISA检测方法等 .方法 用较高纯度的FX免疫Balb/C小鼠 ,经过 2次基础免疫 ,1次加强免疫 ,3d后取其脾细胞与骨髓瘤SP2 /0 Ag14细胞在PEG作用下进行细胞融合 ,经间接ELISA法筛选杂交瘤细胞株 ,通过免疫印迹试验、交叉反应试验、相加试验和二价金属离子依赖性试验等 ,对单克隆抗体进行鉴定 .结果 经 3～ 4次克隆化后获得了 10株能稳定分泌FX单克隆抗体 (FXMcAb)的杂交瘤细胞株 ,Ig亚类均为IgG1型 ,小鼠腹水效价均在 10 6以上 ,FXMcAb只与FX抗原起特异性反应 ,FXMcAb与FX抗原的结合不同程度地依赖于二价金属离子Zn2 + .结论 所筛选出的FXMcAb为高纯度FX的提取和缺乏FX血浆的制备以及FX抗原的ELISA检测方法的建立 ,提供了试剂准备 .

不溶性血小板膜颗粒的制备及其功能初探

目的制备具有止血功能的不溶性血小板膜(IPM)颗粒。方法过期的浓缩血小板经过差速离心去除红细胞、白细胞和血浆,用生理盐水悬浮,经冻融破碎、离心洗涤、超声匀浆,获得大小较均一的IPM颗粒;检测其理化和功能指标:IPM颗粒大小、表面蛋白受体、聚集功能和凝血酶生成能力。结果制备得到的IPM颗粒大小为140nm左右,其表面含有糖蛋白GPⅠbα(CD42b)、糖蛋白GPⅡb-Ⅲa(CD41/CD61)、血小板内皮细胞粘附分子(CD31)、P-选择素(CD62p);体外功能试验显示:IPM颗粒在瑞斯托霉素和Ⅲ型胶原诱导下能发生聚集;凝血酶生成试验证实:IPM能为凝血因子Ⅹ酶复合物和凝血酶生成提供催化表面,参与凝血级联反应。结论应用冻融和超声相结合的方法成功制备出大小均一的IPM颗粒,其表面保留了与止血功能相关的蛋白受体;在血小板聚集诱导剂的刺激下IPM颗粒可以发生聚集反应,初步表现为止血功能。