生物发酵在果渣类饲料开发中的应用

1果渣的营养成分 果渣是果品加工后的废渣,其主要成分为水分、果胶、蛋白质、脂肪和粗纤维等。鲜果渣的含水量约70%。如：沙棘籽含有18种氨基酸,氨基酸总量居各种果渣氨基酸含量之首;

作用于不同活性位点的单胺氧化酶抑制剂

从单胺氧化酶(MAO)活性位点的角度,介绍了近年来报道的单胺氧化酶抑制剂,其包括作用于"Aromatic Cage"、I2型咪唑活性位点的单胺氧化酶抑制剂以及作用于单胺氧化酶通道的抑制剂,对这些作用于不同活性位点的抑制剂的分析将对认识和研究酶的结构和功能具有重要的指导作用,同时也为研究高活性和高选择性的抑制剂提供新的思路和方法。

环氧树脂固定化L-谷氨酸氧化酶

通过环氧树脂作为载体对经(NH4)2SO4盐析处理后的L-谷氨酸氧化酶(LGOX)进行固定化,优化固定化工艺条件,并利用固定化LGOX转化产α-酮戊二酸(α-KG)。结果表明:饱和度45%的(NH4)2SO4为最佳盐析浓度;当选用环氧树脂ES-105作为固定化载体、树脂加量为20 m L酶液(14 U/m L)加入3.5 g载体、固定化K3PO4缓冲液浓度为0.2 mol/L(p H 7.0)、固定化温度25℃、固定化时间24 h时,固定化LGOX酶活力最高,其酶活回收率为85.9%,比酶活55.7 U/g。利用该固定化酶转化L-谷氨酸产α-KG,当谷氨酸钠质量浓度为100 g/L,反应20 h,产物收率达98.2%。固定化酶重复使用14批次后,产物收率仍有90%以上;重复使用20批,收率有83.2%。因此,该固定化酶具有具良好的操作稳定性。

一菌双酶法转化富马酸生成β-丙氨酸

利用天冬氨酸转氨酶(AspAT)和L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD)偶联,以富马酸和氨作为底物催化合成β-丙氨酸(β-Ala)是工业合成β-丙氨酸的重要途径。但传统的双酶工艺需要分别发酵两个酶,且酶无法固定化。通过将AspAT和PanD构建入同一个大肠杆菌中,使其通过一次发酵就能产生两个酶,并且通过固定化通透细胞使酶可以重复利用。构建的工程菌的整体酶活为85.4U/g,固定化率为64.2%,固定化细胞最适反应温度为45℃,最适反应pH为7.5,最高可将质量浓度为300g/L的富马酸完全转化生成β-Ala,固定化细胞可连续使用12次。根据笔者提出的方法可简化酶的发酵工艺,进一步降低β-Ala的生产成本。

金针菇菌丝体的液体发酵工艺研究

以腺苷含量和菌丝体干重为参考指标,通过正交试验确定了金针菇菌丝体发酵的最佳液体培养基组成。结果表明:金针菇菌丝体液体培养基最佳氮源为低温豆饼粉和玉米浆干粉;最佳碳源为膨化玉米粉和蔗糖;最佳培养基组成为10g/L玉米浆干粉,25g/L膨化玉米粉,30g/L蔗糖,20g/L低温豆饼粉,3g/L KH2PO4和1.5g/L MgSO4·7H2O。在200L发酵罐中放大培养过程,接种量为15%,发酵周期为45～55h,每升培养液获得的金针菇菌丝体成品干重可达24.0g,腺苷质量分数高达394.6μg/g,比企业前期成品提高了97.0%。

三酶偶联全细胞生物合成L-酪氨酸

通过将醛缩酶(ALD)、D-丝氨酸脱水酶(SDH)和酪氨酸酚裂解酶(TPL)三酶偶联,催化甘氨酸、甲醛和苯酚合成L-酪氨酸(L-Tyr)。并以L-Tyr的质量浓度为指标对转化工艺进行了考察。结果表明:三酶偶联最佳反应条件为pH=8.5、温度35℃、乙酸铵质量分数6 g/L、磷酸吡哆醛(PLP)质量浓度0.1 g/L、3种酶细胞配比m(ALD)∶m(SDH)∶m(TPL)=6∶3∶5。当甘氨酸加量为50 g/L,利用上述工艺进行10000 L放大,反应11 h,L-Tyr质量浓度可达117 g/L,苯酚转化率为97%,转化体系放大后苯酚转化率提高4%,收率为85%。

固定化天冬氨酸酶制备(R)-3-氨基丁酸

从芽孢杆菌Bacillus sp.YM55-1基因组中克隆得到天冬氨酸酶基因,以pET-28a(+)为载体构建天冬氨酸酶基因的表达载体pET-28a(+)-Asp,将天冬氨酸酶基因进行定点突变,在E.coli BL21(DE3)系统中实现了天冬氨酸酶的异源表达。利用重组的天冬氨酸酶,以氨水、(NH 4)2SO 4为辅料,将底物巴豆酸转化为(R)-3-氨基丁酸。将天冬氨酸酶的工程菌制备成固定化细胞,通过反应条件的优化研究,提高底物的转化率。结果表明:天冬氨酸酶最适pH为9.0,最适反应温度为40℃。在此反应条件下,加入30 g/L固定化细胞,转化22 h,(R)-3-氨基丁酸质量浓度达到220 g/L,对映体过量值e.e.s≥99.95%,底物转化率达到98%,固定化细胞重复使用次数不低于24次。

化学酶法制备盐酸甲氧那明的工艺研究

本文设计和改良了一种化学酶法合成盐酸甲氧那明的新工艺,以氧化还原酶作为催化剂,将2-甲氧基苯丙酮还原为2-甲氧基苯基异丙醇,利用对甲苯磺酰氯、三乙胺和甲胺通过羟氨基化制备甲氧那明。考察了酶催化工艺中最佳辅酶用量、底物浓度、投酶(菌体)量、反应温度和反应pH。考察了化学合成中原料摩尔投料比对反应收率、产物纯度的影响。结果表明,在2-甲氧基苯基异丙醇的酶催化制备中辅酶NAD的最佳投加量为0.2g/L,菌泥的最优添加量为30g/L,2-甲氧基苯丙酮的最佳浓度为80g/L,反应最适宜温度为37.0℃,反应最适宜pH为7.0左右。在1-(2-甲氧基苯基)-2-(4-甲基苯磺酸酯)-丙基的制备中,2-甲氧基苯基异丙醇、三乙胺、对甲苯磺酰氯的最佳摩尔投料比为1.0∶1.2∶1.2。在制备2-甲氧基苯丙甲胺的反应中,1-(2-甲氧基苯基)-2-(4-甲基苯磺酸酯)-丙基、对甲苯磺酸、甲胺乙醇溶液(质量分数33%)的最佳摩尔投料比为1.0∶1.2∶1.5。该工艺采用化学法与酶法相结合,减少有机化学试剂的使用及污水排放,具有良好的工业化前景。

亮氨酸脱氢酶偶联NADH再生体系合成L-2-氨基丁酸

文中以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,构建两株分别共表达亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/甲酸脱氢酶(FDH,来源水生弯杆菌)和亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/醇脱氢酶(ADH,来源红球菌)的重组大肠杆菌。通过偶联两种不同NADH再生体系,以L-苏氨酸为起始原料,利用苏氨酸脱氨酶(L-TD)与LDH-FDH或LDH-ADH一锅法合成L-2-氨基丁酸,并对LDH-FDH工艺和LDH-ADH工艺进行对比优化。LDH-FDH工艺的最适反应pH为7.5,最适反应温度为35℃,通过加入50 g/L甲酸铵、0.3 g/L NAD^+、10%LDH-FDH粗酶液(V/V)和7500 U/L的L-TD酶液,对L-苏氨酸进行分批补加,以便控制2-丁酮酸浓度小于15 g/L,反应28 h,实现了L-2-氨基丁酸的产量为161.8 g/L,产率97%。LDH-ADH工艺的最适pH为8.0,最适反应温度为35℃,通过加入0.3 g/L NAD^+、10%LDH-ADH粗酶液(V/V)及7500 U/L的L-TD酶液,分批补加L-苏氨酸及1.2倍摩尔量异丙醇,以便控制2-丁酮酸浓度小于15 g/L,且每生成约40 g/L的L-2-氨基丁酸,抽真空去除丙酮,反应24 h,实现了L-2-氨基丁酸的产量为119.6 g/L,产率98%。文中所采用的工艺及结果可为L-2-氨基丁酸的工业化提供一定的参考依据。

固定化细胞拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的研究

【目的】筛选鉴定一株产酯酶用于选择性拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的菌株,利用该菌株固定化细胞催化拆分外消旋底物。【方法】通过富集培养、罗丹明B平板初筛及复筛培养获得一株选择性拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的菌株,通过对其形态、生理生化特征及16S r DNA序列分析,确立该菌株系统发育地位。优化了利用硅藻土-戊二醛吸附交联法对该菌体细胞固定化的条件,研究固定化细胞催化性质及操作稳定性。【结果】该菌为革兰氏阴性菌,鉴定其为甲基球状菌属(Methylopila)。固定化体系最优条件:聚乙烯亚胺0.15%(V/V),戊二醛0.2%(V/V),硅藻土6 g/L,菌体质量浓度100 g/L。与游离细胞相比,固定化细胞最适p H由8.0变为8.5,最适温度由35°C变为40°C,p H稳定性和温度稳定性都有所提高。Cu^(2+)、Mn^(2+)、Ca^(2+)能促进酶活,Zn^(2+)、Fe^(2+)抑制酶活。固定化细胞的有机溶剂耐受性较游离细胞有所提高。动力学分析细胞固定化后Km值变大,底物亲和力降低。利用固定化细胞水解(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯,底物浓度200 g/L,反应20 h,保留构型为S型,得率47.8%,对映体过量值ees为99.4%,重复使用12次后仍保留初始酶活的80%以上。【结论】开发了利用Methylopila sp.cxzy-L013固定化细胞择性拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的工艺,该工艺具有良好的工业应用前景。