云南省南部地区蚊携带乙型脑炎病毒的检测和遗传进化分析

为探索云南省南部地区乙型脑炎病毒(JEV)的流行及基因变异情况,将2016年8—10月在南部4个县级地区采集的6 952只蚊,根据采集地和蚊种合并为69份样品,采用RT-PCR检测JEV并进行基因分析。结果显示:检出7份JEV阳性样品,平均阳性率为10.14%,其中思茅区和宁洱县蚊阳性率最高,均为25.00%;扩增的5条完整JEV E基因序列与2009年分离的JEV老挝株亲缘关系最近,同源性为97.3%~98.7%,均属于基因I型;5条E基因序列(YN2016-1/2/3/4/5)在1 323位核苷酸位点首次出现C碱基替换,且YN2016-1在第340位氨基酸位点首次出现丙氨酸替换。结果表明:云南省南部地区蚊JEV的携带率较高,尤其是思茅区和宁洱县;蚊携带的JEV出现了核苷酸和氨基酸变异,应注意对其加强监测。

InSCC拓扑结构的能控性分析

为研究一类多智能体系统的能控性,首次提出输入强连通分量(Input strongly connected component,InSCC)的概念,利用PBH判据、图理论等知识进行分析。分析了InSCC结构的能控性,以及InSCC和路图共同组成的拓扑结构的能控性,给出了领导者的选择方法以实现系统能控;以InSCC结构为基础,研究了在不同InSCC结构之间以及路图中增加通讯边对系统能控性的影响。研究发现:对于含有InSCC,以及InSCC和路图共同组成的拓扑,按一定方式增加通讯边并不改变系统的能控性,进而提出了一类能控拓扑的构造方法,给出了含有InSCC结构的多智能体系统在切换拓扑下能控的充要条件。

犬圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

犬圆环病毒(DogCV)是圆环病毒科新发现的圆环病毒,旨在建立犬圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法。试验用PCR方法克隆犬圆环病毒ORF2基因保守区域,构建标准阳性质粒pClon007-ORF2。以标准阳性质粒pClon007-ORF2为模板对荧光定量PCR反应体系进行优化。结果表明,所建立的方法 Ct值与标准品在4.67×10~9 copies/μL^4.67×10~3 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-3.445。该方法检测灵敏度为4.67×10~1copies/μL。该方法对狂犬病病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型等犬常见病原的检测均无交叉反应;所有稀释度标准品模板均在83.35℃出现窄的特异性熔解峰。临床样品检测表明,所建立的实时荧光定量PCR对犬圆环病毒的阳性检测率为12.50%(4/32)。

猪细小病毒7型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立猪细小病毒7型(PPV7)的快速定量检测方法,本研究根据PPV7(KU563733.1)基因序列设计一对特异性引物,扩增155 bp的PPV7衣壳蛋白基因,构建重组质粒pClon007-PPV7,以其作为标准品建立了PPV7的SYBR GteenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在5.00×10~9拷贝/μL^5.00×10~3拷贝/μL范围内呈良好的线性关系。该方法对猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病毒、乙脑病毒、口蹄疫病毒常见病原的检测均无特异性扩增,仅PPV7出现特异性扩增;该方法检测灵敏度可达5.00×10~1拷贝/μL;批内和批间变异系数均低于1%,具有较高的重复性和稳定性。对临床样品的检测结果显示,所建立的荧光定量PCR阳性检测率为71.88%,比普通PCR法检测的阳性率提高了约4.55%。该研究方法的建立为PPV7提供了一种新的快速定量检测技术。

边破坏对多智能体系统能控性的影响

针对多智能体系统中边遭受破坏对能控性影响的问题,基于多智能体控制系统理论,结合状态空间模型以及图理论知识,提出了一种新方法辨识多智能体中不同类型的边。根据系统中边遭受破坏而失效的情况,将边分为三种类型和四种不同的组合类型,并给出了辨识边分类的算法。另外,基于此分类方式,给出了边失效对系统的能控性及拉普拉斯矩阵秩的变化规律。当不同类型的边失效时,给出了领导者的选择方式,保证边失效后多智能体系统是能控的,通过实例验证了边失效时的变换规律。

滑动载荷作用下关节软骨不同层区的法向位移

目的获得滑动载荷作用下关节软骨不同层区的法向位移分布,探讨压缩应变、滑动速率和滑动次数对不同软骨深度法向位移的影响。方法以新鲜猪关节软骨为研究对象,采用非接触式数字图像相关技术,对滑动载荷作用下软骨不同层区的法向位移分布进行研究。结果滑动载荷作用下,关节软骨表层的法向位移最大,深层的法向位移最小,中间层的位移介于二者之间;随着压缩应变的增大,沿软骨厚度方向的法向位移都增大,并且表层的法向位移增加幅度最大。滑动速率越大,软骨沿厚度方向的法向位移越小。在不同的滑动次数下,法向位移随滑动时间的进行都呈上升趋势;随着滑动次数的增加,不同滑动时间时的法向位移都增大,并且发现从第1次到第2次滑动时法向位移增大最明显。结论滑动载荷作用下,软骨不同层区的法向变形有差异,不同层区的法向位移随着压缩应变、滑动速率和滑动次数的变化而变化。本研究可以为临床软骨疾病治疗和软骨缺损修复等方面提供依据,同时对人工软骨结构组成、人工构建、力学功能评价有重要意义。

关节软骨不同层区的率相关性能研究

目的采用不同加载速率对关节软骨进行非围限压缩试验,探究其不同层区的率相关性能。方法采用新鲜猪关节软骨作为研究对象,结合非接触式数字图像相关技术,测试不同加载率下软骨不同层区的力学性能。结果在恒定加载率作用下,取相同压缩应力时,软骨浅表层的压缩应变最大,深层区压缩应变最小,中间层压缩应变鉴于表层与深层之间;沿软骨厚度方向,从浅表层到深层,软骨的泊松比逐渐增大;不同加载率作用下,软骨的压缩应力-应变曲线不重合,说明关节软骨的压缩力学性能具有率相关性;随着加载速率的增大,软骨的弹性模量呈增大的趋势;取相同压缩应力时,加载率越大,不同层区的压缩应变都减小。结论关节软骨沿厚度方向,从浅表层到深层的压缩应变逐渐减小,泊松比逐渐增大,软骨不同层区的力学性能具有率相关性。实验研究可为临床软骨疾病预防、治疗提供理论依据,同时对人工软骨力学评价具有重要意义。

非侵入性血流检测法辅助卒中后抑郁模型的建立

卒中后抑郁是脑卒中患者发病率最高的精神障碍性疾病,其发病机制复杂,缺乏有效治疗性药物。为了建立更高效的小鼠动物模型,以研究该病发生机制、评估药物疗效,通过改良手术方案,并用激光散斑血流成像系统对造模试验进行非侵入性血流检测法辅助构建卒中后抑郁小鼠模型。结果表明,该方法可在造模过程中,实时、准确判断给药位置及药物作用效果,经过蔗糖偏好试验、悬尾试验等行为学检测方法,证明激光散斑血流成像系统辅助方法能够有效监控手术过程,提升卒中后抑郁Balb/c小鼠模型建立的成功率。

一种建筑爬架焊接工装结构设计

本文通过分析现有爬架在焊接前的安装、拆卸方式,设计了一种能实现快速准确定位的装夹机构。同时,爬架焊接完成后可以通过顶起机构顶起,从而被工作人员轻松取下来,降低了工人的劳动强度,大大提高了生产效率。

重组痘苗病毒rVTT-JEVE理化特性研究

目的痘苗病毒作为疫苗载体具有接种途径简单、高滴度、低成本等优点,重组痘苗病毒投入使用之前进行理化特性试验,对重组痘苗病毒的生产、运输和保存有一定重要意义。方法将重组痘苗病毒rVTT-JEVE作热、酸、碱、乙醚、氯仿、胰蛋白酶、超声波以及紫外线处理,然后接种到BHK-21细胞上,观察rVTT-JEVE毒价的变化,分析理化因素对rVTT-JEVE的影响。结果在pH3～9范围内,酸碱度变化不会引起rVTT-JEVE毒价的显著变化。rVTT-JEVE经50℃处理60min、30min和60℃处理15min可被灭活；对5%的氯仿敏感；经终浓度0.5%的胰蛋白酶37℃作用1h,病毒毒价降低2个滴度；对25%的乙醚不敏感；经40KHz超声波处理60min和80KHz处理30min即可灭活；30W紫外灯垂直距离10cm照射15min、30cm照射30min即可灭活。结论 rVTT-JEVE耐热、酸、碱、乙醚、氯仿及胰蛋白酶,对超声波、紫外线较敏感。

乙型脑炎重组痘苗病毒候选疫苗小鼠安全性评价

目的对重组痘苗病毒候选疫苗rVTT-JEVE进行动物安全性评价。方法用重组痘苗病毒rVTT-JEVE对BALB/c小鼠进行免疫接种,分别在体液免疫及细胞免疫水平上评价其免疫效果;并通过检测小鼠体内rVTT-JEVE病毒残留,分析乙型脑炎重组痘苗病毒候选疫苗rVTT-JEVE的安全性。结果 BALB/c小鼠经两次免疫接种后,重组痘苗病毒rVTT-JEVE组IgG抗体水平是商品疫苗SA-14-14-2组的1.4倍(t=3.704,P<0.05),中和抗体效价是SA-14-14-2组的1.6倍(t=4.418,P<0.05),T淋巴细胞增殖水平为SA-14-14-2组的1.7倍(t=3.092,P<0.05)。rVTT-JEVE接种小鼠后第1d各脏器均有rVTT-JEVE病毒残留,第3d颌下淋巴结已无病毒残留,第7d仅脾脏和雄性小鼠心脏有少量病毒残留,之后均无病毒残留。结论重组痘苗病毒候选疫苗rVTT-JEVE免疫小鼠可产生较好的免疫效果及免疫安全性。

欧洲型PRRSV重组腺病毒疫苗的构建及免疫效果评价

目的构建欧洲型PRRSV重组腺病毒疫苗并对其免疫原性进行分析,为欧洲型PRRSV的感染预防提供依据。方法 PCR扩增欧洲型蓝耳病病毒ORF3、ORF5目的基因,将其连接到腺病毒穿梭载体,构建重组腺病毒穿梭质粒pacad-EU-ORF3、pacad-EU-ORF5、pacad-EU-ORF3-ORF5。将重组腺病毒穿梭质粒与骨架质粒共同转染至HEK 293细胞,构建重组腺病毒,并对构建的病毒用Western blot方法进行验证。用构建的重组腺病毒免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞增殖试验对重组疫苗免疫效果进行初步评价。结果 Western blot显示重组腺病毒可稳定表达目的蛋白ORF3和ORF5,分子质量单位分别为30ku和22ku,与预期值相符。免疫小鼠淋巴细胞增殖试验显示重组腺病毒刺激指数均为PBS组1.5倍以上(P<0.05),且rAd-EU-ORF3-ORF5组显著高于rAd-EU-ORF3组和rAd-EU-ORF5组,表明重组腺病毒疫苗能够诱导机体淋巴细胞增殖,增强机体的细胞免疫应答水平。结论成功包装出重组腺病毒rAdEU-ORF3、rAd-EU-ORF5和rAd-EU-ORF3-ORF5,动物实验显示其具有良好的免疫原性。

新城疫病毒NP和P基因辅助质粒的构建及鉴定

目的构建新城疫病毒JL02/2000株P和NP基因真核表达质粒,并在BHK-21细胞中表达,为该病毒的反向遗传操作系统的建立奠定了基础。方法根据新城疫病毒(JL02/2000毒株)的全基因组中的NP、P基因分别设计引物,应用RT-PCR方法扩增NP基因和P基因,将扩增的NP基因和P基因片段连接到pMD18-T载体上,限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切鉴定确认后回收目的条带,分别插入到真核表达载体pCI上,经测序确认pCI-NP、pCI-P辅助质粒的构建。将pCI-NP、pCI-P转染BHK-21细胞,两次换液,72h后回收细胞,经RT-PCR检测NP和P基因片段。结果构建的辅助质粒pCI-NP和pCI-P经双酶切和测序鉴定到目的片段。pCI-NP、pCI-P转染后,RT-PCR检测到NP和P基因片段。结论新城疫病毒pCI-NP、pCI-P辅助质粒构建成功,pCI-NP、pCI-P可在BHK-21细胞中表达,为该病毒的反向遗传操作系统的建立奠定了基础。

牛支原体P81蛋白的表达及纯化

目的构建3种牛支原体P81蛋白原核表达质粒,分析其在大肠埃希菌中的表达情况,并纯化P81蛋白。方法根据GenBank发表的牛支原体P81基因序列(GenBank登录号:AY627040.1),密码子优化后合成P81全基因序列。构建原核表达质粒pET28a-P81、pET32a-P81和pGEX-6P-1-P81,经IPTG诱导后采用SDS-PAGE电泳分析P81蛋白在原核表达系统中的表达情况;应用Ni-NTA对目的蛋白进行纯化。结果pET28a-P81、pET32a-P81和pGEX-6P-1-P81均高效表达分子质量单位为78ku左右的P81蛋白。表达产物进行Ni-NTA亲和层析,得到纯化的P81蛋白。结论构建的重组原核表达质粒pET28a-P81、pET32a-P81、pGEX-6P-1-P81能在大肠埃希菌中高效表达牛支原体P81蛋白,为进一步分析该蛋白的抗原性奠定了基础。

欧洲型PRRSV、PCV2二联重组痘苗病毒疫苗猪体免疫实验研究

目的评价实验室构建的欧洲型PRRSV和PCV2二联重组痘苗病毒猪体免疫效果。方法分别用重组痘苗病毒rVTT-PCV2-ORF2-EU-ORF3-ORF5和rVTT-EU-ORF3-ORF5进行猪体免疫试验,每周采血,分离血清,采用ELISA检测病毒特异性抗体、中和抗体检测及细胞因子水平,评价免疫效果。结果 rVTT-PCV2-ORF2-EU-ORF3-ORF免疫组35d时,猪血清欧洲型PRRSV GP3和GP5及PCV2ORF2特异性抗体,显著高于野毒组(t=6.61,t=9.21,t=10.34,P<0.05);猪血清中和抗体35d时,各免疫组均可产生较高的免疫水平,差异均无统计学意义(t=0.48,P>0.05);重组痘苗病毒疫苗rVV-ORF2-EU-ORF3-ORF5免疫可诱导IL-4和IFN-γ产生,增强猪体细胞免疫应答水平。结论欧洲型PRRSV、PCV2二联重组痘苗病毒疫苗能诱导猪体产生体液和细胞免疫应答,为欧洲型PRRSV、PCV2的新型疫苗研究奠定了实验基础。

转瓶培养与生物反应器微载体培养重组腺病毒的比较

目的分别用3L转瓶和7L生物反应器微载体系统培养人胚胎肾细胞（HEK-293细胞）并接种H3型流感重组腺病毒,比较两种方法培养细胞及重组腺病毒的效果。方法分别用3L转瓶和7L生物反应器培养HEK-293细胞。转瓶每24h取样,生物反应器每12h取样,记录细胞总数。待细胞长满表面85%~90%时接种流感重组腺病毒,完全病变后收取病毒液并测定病毒滴度。结果转瓶培养HEK-293细胞3d,细胞增殖增加1.85~2.45倍,为（3.71~4.90）×107个[（2.95~3.90）×104 cells/cm2],生物反应器培养3d,细胞增长4.72~5.00倍,为（132.15~140.09）×107个[（24.88~28.72）×104cells/cm2]。转瓶培养重组腺病毒滴度为6.85TCID50/ml,生物反应器微载体系统培养腺病毒滴度为7.200TCID50/ml。结论生物反应器微载体系统培养流感重组腺病毒数量和滴度均高于转瓶培养,不但提高了疫苗的产量,还减少了细胞分泌物的残留,增强了疫苗接种的安全性。

2015年广西地区PRRSV流行株ORF5和Nsp2基因分子流行病学调查

目的对广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2和ORF5基因进行分子流行病学调查。方法采集广西地区猪病料样品45份,PCR扩增PRRSV毒株Nsp2和ORF5基因并进行遗传进化分析。结果 RT-PCR检测PRRSV 7份猪病料阳性。7株病毒与VR-2332和LV株的同源性分别为83.5%88.7%和62.1%64.8%。遗传进化分析显示,7株病毒分属于两个亚群,3株属于亚群Ⅳ,4株属于亚群Ⅵ。Nsp2序列分析显示,6株病毒有高致病性PRRSV 1+29aa氨基酸的缺失特征,其中GXBB11-2015在此基础上出现了新的20个氨基酸缺失,缺失碱基数为150个碱基。结论高致病性PRRSV已成为广西地区优势毒株,病毒Nsp2基因新的碱基缺失是PRRSV变异的又一证据。

欧洲型PRRSV重组痘苗病毒候选疫苗猪体免疫效果研究

目的通过猪体免疫试验,评价欧洲型PRRSV重组痘苗病毒灭活疫苗的免疫效果。方法分别用重组痘苗病毒rVV-EU-ORF3-ORF5和灭活rVV-EU-ORF3-ORF5进行猪体免疫试验,通过检测猪血清特异性抗体中和抗体检测及T淋巴细胞增殖试验分析免疫效果。实验设E3L-VTT野毒免疫组和PBS组作对照。结果免疫后35d,欧洲型PRRSV重组痘苗病毒灭活疫苗免疫组和rVV-EU-ORF3-ORF5免疫组GP3、GP5特异抗体水平均达峰值（A值0.51~0.56）,两组间比较差异无统计学意义（tGP3=1.805,tGP5=0.7998,P〉0.05）,但均高于E3L-VTT野毒免疫组（A值0.33~0.43）,差异显著（tGP3=5.518,tGP5=3.346,P〈0.01）;猪血清中和抗体重组痘苗病毒灭活疫苗组与重组痘苗病毒疫苗组均与免疫后35d达峰值水平（分别为16.38和18.88）,且两组间比较差异无统计学意义（t=0.7005,P〉0.05）;T淋巴细胞增殖试验的SI值两疫苗组差异无统计学意义（t=0.2536,P〉0.05）,但均高于E3L-VTT野毒免疫组（t值分比为6.414和7.222,P〈0.01）。结论欧洲型PRRSV重组痘苗病毒灭活疫苗能诱导猪体产生体液和细胞免疫应答,可为欧洲型PRRSV的新型疫苗的研制提供参考。

基孔肯雅病毒E1基因重组腺病毒的构建、鉴定及稳定性

构建表达基孔肯雅病毒E1蛋白的重组腺病毒，鉴定该重组腺病毒，并对该重组腺病毒的稳定性进行研究。本研究通过构建重组腺病毒穿梭质粒Ad5-EGFP—CHIKVE1，将质粒Ad5-EGFP—CHIKV—E1与腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞获得重组腺病毒rAd5EGFP—cHIKv—E1，并通过Westernblot与PCR方法鉴定E1基因表达的稳定性。PCR鉴定结果表明重组腺病毒可扩增1323bp大小的条带；经Westernblot鉴定重组腺病毒可表达大小为52000的E1蛋白。结果表明，重组腺病毒rAd5-EGFPCHIKVE1可以成功表达基孔肯雅病毒E1基因；提取第0，2，4，6，8，10，12，14，16代重组腺病毒基因组，经PCR鉴定证实重组腺病毒在16代内稳定性良好。成功构建出表达基孔肯雅病毒E1基因的重组腺病毒rAd5EGFP—CHIKV—E1，该病毒可以稳定表达，为研发基孔肯雅病毒疫苗奠定基础。

H3亚型流感重组腺病毒的纯化工艺研究

目的为了探索经济、高效的腺病毒的纯化工艺,采用阴离子交换层析和分子筛层析两步法对H3亚型流感重组腺病毒pacAd-H3-EHA-H1HA1new进行纯化,并评价纯化效果。方法利用7L生物反应器培养HEK-293细胞,用于对H3型流感重组腺病毒进行扩增;利用冻融的方法使病毒从细胞中释放,通过阴离子交换层析和分子筛层析法纯化病毒,用分光光度计检测纯化样品的纯度,并测定病毒的滴度和回收率。结果纯化后的样品经PCR鉴定正确,纯化前后的病毒滴度分别为5.6×10~9 TCID_(50)/ml和1.1×10^(10) TCID_(50)/ml,纯化后样品纯度(A260/A280值)分别为2.01和1.26,阴离子交换层析纯化的回收率为31.5%,分子筛层析纯化的回收率为81.4%,总回收率为25.6%。结论利用阴离子交换层析和分子筛层析两步法纯化H3亚型流感重组腺病毒的回收率和滴度高,该方法可用于重组腺病毒的纯化。