护肝清脂颗粒的质控研究

目的:研究护肝清脂颗粒的质量控制方法。方法:采用薄层色谱法定性鉴别复方中泽泻、山楂、荷叶、蒲黄和三七药材;采用HPLC法对复方中香蒲新苷、金丝桃苷、荷叶碱和23-乙酰泽泻醇B的含量进行测定。采用Waters Symmetry C_(18)(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以0.1%磷酸溶液(A)-乙腈(B)为流动相,流速1.0 mL/min,分段变波长检测,柱温40℃,进样量10μL。结果:泽泻、山楂、荷叶、蒲黄和三七的TLC图斑点清晰,阴性对照无干扰。香蒲新苷、金丝桃苷、荷叶碱和23-乙酰泽泻醇B检测浓度线性范围分别为18.6～186.2μg/mL、22.9～228μg/mL、2.0～20.1μg/mL、7.7～76.8μg/mL;精密度、重复性及稳定性良好(RSD<2.0%);加样回收率分别为99.87%～105.0%、95.15%～96.93%、98.00%～101.1%、96.65%～99.98%。结论:建立的薄层色谱法和高效液相色谱法简便、准确,适用于护肝清脂颗粒的质量控制。

护肝清脂片药物血清对非酒精性脂肪肝细胞模型内质网应激的影响

目的探讨护肝清脂片药物血清对混合脂肪酸诱导的非酒精性脂肪肝HepG2细胞模型内质网应激(ER stress)的影响及其可能机制。方法油酸和棕榈酸以2∶1比例混合制备成1 mmol/L游离脂肪酸(FFA)混合液,诱导HepG2细胞24 h发生脂肪变性,建立NAFLD体外模型,将HepG2细胞分为对照组(CON)、FFA组、护肝清脂片低剂量组(HG-L)、护肝清脂片中剂量组(HGM)、护肝清脂片高剂量组(HG-H)及非诺贝特阳性对照组(FF),在加入1 mmol/L FFA前分别加入各组对应的药物血清作用24 h,CON组及FFA组则加入大鼠空白血清作为对照。油红O染色观察细胞内脂滴分布;试剂盒检测细胞内甘油三酯(TG)含量及培养上清液谷草转氨酶(AST/GOT)、谷丙转氨酶(ALT/GPT)的水平;透射电镜观察细胞内质网形态结构的改变;Western blot、qRT-PCR技术检测ERS相关信号分子GRP78、PERK、p-PERK、ATF6、ATF4、XBP-1、CASPASE-12、CHOP、PKC-δ、p-PKC-δ蛋白及(或)mRNA的表达情况。利用siRNA瞬时转染技术沉默PKC-δ在HepG2细胞中的表达后观察GRP78、PERK、p-PERK、CASPASE-12和CHOP蛋白表达变化。结果与CON组相比,FF组HepG2细胞油红染色可见红色脂滴密布细胞质,TG、AST、ALT含量升高(P<0.001);与FF组相比,HG-L、HG-M、HG-H及FF均在不同程度上降低TG、AST、ALT含量,减少细胞内脂滴堆积,差异有统计学意义(P<0.05),并能够在蛋白及mRNA水平上有效地下调ERS相关信号分子GRP78、p-PERK、ATF6、ATF4、CHOP、CASPASE-12、XBP-1、PKC-δ、p-PKC-δ的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。在1 mmol/L FFA共同作用下,PKC-δsiRNA转染组GRP78、p-PERK、CHOP、CASPASE-12蛋白表达均较对照组明显下调,差异具有统计学意义(P<0.001)。然而,与PKC-δsiRNA+FFA组相比,PKC-δsiRNA+HG-H组GRP78和P-PERK表达下调更显著(P<0.001,0.01),CHOP和CASPASE-12则无统计学差异(P>0.05)。结论护肝清脂片药物血清可以有效地防治混合脂肪酸诱导的NAFLD细胞模型脂肪变性,改善HepG2功能状态,有效地缓解1 mmol/L游离脂肪酸所致的内质网应激,其作用机制在一定程度上与下调PKC-δ表达有关。