人脑胶质瘤细胞来源外泌体的提取鉴定及微环境中的摄取

目的探讨提取、鉴定及观察细胞对外泌体在微环境中的摄取,为后续开展胶质瘤外泌体相关的研究建立稳定的提取方法,以及更清楚地观察到外泌体奠定基础,为今后研究提供一定的参考。方法运用超速离心法从人脑胶质瘤细胞培养上清液中分离外泌体以及观察在肿瘤细胞微环境中肿瘤细胞对外泌体的摄取,通过透射电子显微镜观察外泌体的大小、形态特点,通过马尔文粒径分析确定外泌体粒径的大小,应用Western blotting法进行外泌体特异性抗原分子CD63、TSG101的鉴定,采用荧光共聚焦显微镜观察胶质瘤细胞摄取外泌体。结果通过透射电子显微镜观察到从人脑胶质瘤U251细胞的培养上清液中分离出来的呈圆形杯盘样结构的囊泡样物质,其外形呈典型的杯状和双凹圆盘的扁平球囊体且具备完整的膜结构,粒径大小为30~150 nm,Western blotting结果显示其表达外泌体特异性蛋白CD63、TSG101;外泌体通过细胞内吞噬作用形成、分泌和释放,通过荧光共聚焦显微镜可以证实其有效摄取外泌体,主要集中于细胞质。结论人脑胶质瘤U251细胞中提取分离得到具有双层膜结构茶托样囊泡物质,鉴定其为外泌体,并能观察细胞摄取外泌体集中分布于细胞质。

EphB3通过PI3K/AKT信号通路对胶质瘤细胞侵袭及迁移的影响

目的探究促红细胞生成素产生的肝细胞受体B3(EphB3)通过PI3K/AKT信号通路对胶质瘤的侵袭、迁移的作用机制。方法通过EphB3慢病毒过表达及EphB3-siRNA感染U87MG、U251细胞系,采用细胞划痕实验、细胞侵袭(Transwell)实验检测细胞的侵袭、迁移能力,采用蛋白印迹法(Western Blot)检测EphB3过表达及siRNA干扰后磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)的蛋白表达,采用细胞多重免疫荧光检测EphB3的过表达及敲低检测EphB3、p-PI3K、p-AKT共表达情况;收集Ⅰ~Ⅳ级胶质瘤组织样本40例,采用免疫组化检测EphB3的表达,组织多重免疫荧光检测EphB3及p-PI3K、p-AKT的共表达。结果U87MG、U251细胞系过表达EphB3后细胞侵袭、迁移能力减弱(P<0.05),敲低EphB3后U87MG、U251细胞侵袭、迁移能力增强(P<0.05);EphB3过表达后p-PI3K、p-AKT表达下降(P<0.05),EphB3敲低后p-PI3K、p-AKT表达升高(P<0.05);临床胶质瘤组织样本结果显示,EphB3的表达与胶质瘤WHO分级呈负相关;多重免疫荧光结果显示,胶质瘤的级别与p-PI3K、p-AKT的荧光信号强度呈正相关。结论EphB3的表达可抑制胶质瘤的侵袭及迁移,其机制可能通过PI3K/AKT信号通路来影响肿瘤细胞的侵袭、迁移。

酪氨酸激酶受体EphA1调控Snail2蛋白影响胶质瘤细胞的侵袭能力

目的探讨酪氨酸激酶受体EphA1对胶质瘤细胞侵袭能力的影响。方法培养正常星形胶质细胞与胶质瘤细胞系U87、U251,分别通过qPCR实验及Western Blot实验检测正常星形胶质细胞与胶质瘤细胞U87、U251中EphA1的mRNA及蛋白表达水平;在U87和U251细胞中设置阴性对照组与实验转染组,阴性对照组转染无意义序列RNA,实验转染组转染EphA1的小干扰RNA降低其表达,通过细胞划痕损伤修复实验观察胶质瘤细胞中下调EphA1表达水平后肿瘤细胞的侵袭能力;在胶质瘤细胞U87和U251中转染EphA1小干扰RNA后,通过Western Blot实验检测EphA1及Snail2的蛋白表达水平。结果胶质瘤细胞U87和U251中EphA1的mRNA及蛋白表达水平均高于其在正常星形胶质细胞表达;在胶质瘤细胞U87和U251中敲低EphA1表达后,肿瘤细胞的侵袭能力明显减弱;在胶质瘤细胞U87和U251中敲低EphA1表达后,Snail2蛋白表达水平明显降低。结论EphA1调控Snail2蛋白影响胶质瘤细胞的侵袭能力。