猪α干扰素在BHK-21细胞中的表达与生物活性分析

为了构建猪α-干扰素(PoIFN-α)的真核表达系统,鉴定其生物学活性,分离猪的外周血淋巴细胞,提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增猪α-干扰素基因序列,克隆至pcDNA3.1(+)载体,并转染BHK-21细胞。通过G418筛选获得稳定转染的细胞株,采用real-time PCR及ELISA测定PoIFN-α基因在BHK-21细胞内的表达,利用淋巴细胞增值试验(MTT)检测表达蛋白的生物学活性。结果表明:稳定整合PoIFN-α基因的BHK-21细胞系其PoIFN-αmRNA的转录效率比阴性对照组提高1.52倍,蛋白表达量显著提高1.35倍。MTT试验表明真核表达PoIFN-α淋巴细胞增值活性与阴性对照组相比差异显著(P<0.01),表明BHK-21细胞表达的PoIFN-α具有良好的生物学活性,为开发新型抗病毒制剂奠定基础。

牛病毒性腹泻病毒纳米抗体文库的构建与鉴定

通过构建牛病毒性腹泻病毒(BVDV)驼源重链抗体文库,并鉴定抗体文库的多样性,为筛选抗BVDV特异性重链抗体奠定基础。利用灭活的BVDV免疫双峰驼,多次免疫后测定血清抗体滴度,采集免疫后的血液并分离其外周淋巴细胞,抽提RNA,用RT-PCR法扩增重链抗体可变区(VHH)片段;将其克隆至载体pCANTAB5E,电转大肠杆菌TG1获得VHH抗体基因库,检测抗体库库容量,随机挑取克隆测序验证抗体文库多样性。结果表明,所构建的抗体文库的库容量为4.32×105;测序和聚类分析表明,抗体文库多样性丰富。利用辅助噬菌体救援后,得到噬菌体展示文库,测定滴度达1.3×1012 cfu/mL。

牛病毒性腹泻病毒纳米抗体文库构建与筛选

旨在获得牛病毒性腹泻病毒(BVDV)特异性纳米抗体。通过用BVDV-E0重组蛋白对羊驼进行免疫,分离血液中的淋巴细胞。利用噬菌体展示技术,构建噬菌体展示文库,经过连续3次生物淘筛获得与BVDV-E0蛋白结合的噬菌体,对所得VHH序列进行测序和基因比对。用ELISA筛选出抗BVDV-E0的高亲和力纳米抗体,并验证纳米抗体的亲和力和活性。结果成功构建了插入率为86%、库容量为1.3×1011 cfu的噬菌体表达文库,经过筛选获得5个BVDV-E0阳性单克隆,将这些基因克隆至原核表达体系,表达和纯化后获得了高纯度的BVDV-E0纳米抗体,经亲和力的鉴定获得2个不同的高亲和力的VHH基因,并且能结合人工抗原E0,还能够被竞争抗体所阻断。研究结果为用于组装检测BVDV试剂盒和研制BVDV疫苗奠定了基础。

仔猪胃肠道优良性状乳酸杆菌的分离和鉴定

从健康仔猪胃肠道不同部位(胃、十二指肠、空肠、结肠)分离乳菌杆菌,对其进行接触酶实验和革兰氏染色、API系统生化鉴定,然后对分离的乳酸杆菌进行小白鼠安全性试验、绘制生长曲线、耐酸和胆盐试验、体外抑菌试验。结果表明:应用完全选择性培养基,从仔猪胃肠道分离疑似60株乳酸杆菌,其中来源于胃部16株,空肠8株,十二指肠4株,结肠22株。经API系统生化鉴定,共有16株乳酸杆菌。其中9株嗜酸乳杆菌,5株发酵乳杆菌,2株唾液乳杆菌。经过筛选,最终确定了2株优良性状的乳酸杆菌。

中国美利奴绵羊磷脂酶C zeta基因的克隆及序列分析

根据GenBank中公布的牛磷脂酶C zeta(PLCζ)基因序列设计引物,通过RT-PCR方法对中国美利奴绵羊的PLCζ基因进行扩增,以了解其分子生物学特征。测序表明,美利奴绵羊PLCζ基因开放阅读框全长1 905bp,共编码634个氨基酸。生物信息学分析所扩增的中国美利奴绵羊PLCζ基因具有典型的EF-hand钙结合结构域、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶X结构域、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶Y结构域、蛋白激酶C2保守区域,其170和215氨基酸位点为组氨酸活性位点。与牛、猪、犬、人、猴、鼠、兔和原鸡的PLCζ基因核苷酸同源性分别为97.32%、88.19%、73.93%、81.42%、83.05%、73.65%、72.42%和65.07%。氨基酸序列的系统进化树表明中国美利奴绵羊PLCζ基因与牛的亲缘关系最近。

新疆哈萨克绵羊MHCⅠ类基因第二、三外显子序列多态性分析

为研究新疆中国哈萨克绵羊主要组织性抗原复合体Ⅰ类基因第二、三外显子的序列多态性,采用PCR和测序的方法对新疆伊犁地区36只哈萨克绵羊MHCⅠ类基因第二、三外显子进行了扩增和测序,并对序列进行了生物信息学分析。结果表明:哈萨克绵羊MHCⅠ类基因第二、三外显子序列具有丰富的多态性,碱基组成具有一定的不平衡性,并且经过了自然选择的作用,与数据库中牛的序列的进化分析显示了跨物种多态性。实验数据为深入研究绵羊MHCⅠ类基因的多态性及绵羊抗病新品种的选育提供理论依据。