基于2D-DIGE/MALDI-TOF-MS技术筛选奶牛低血钙症生物标志物

奶牛乳热(MF)是一种严重的营养代谢性疾病,通常被分为临床型及亚临床型低血钙症(SH)。奶牛乳热的诊断通常是应用奶牛血浆中的钙浓度进行判定的,但是在奶牛乳热整个发生发展的过程中,发病的具体机制仍是研究的盲点。在本试验中通过筛选奶牛乳热、亚临床低血钙症及健康奶牛间生物标志物进而解释可能的发生机制。选取27头奶牛作为实验动物,并根据其血浆钙浓度及有无临床症状分为乳热组(MF组)、亚临床低血钙组(SH组)和正常组(C组)。在组内每3个样品混合成为1个混合样本应用于2D-DIGE试验。结果得到110个差异蛋白质点,选取其中80个点进行MALDI-TOF-MS质谱分析,得到66个阳性结果并整合成为16种蛋白质。根据试验结果,选取A2M、HP和PON1进行Western blotting验证试验。本试验首次证实A2M、HP和PON1是奶牛乳热症3种新的生物标志物,并分析了其在乳热症发生过程中的可能作用机制。

基于核磁共振技术的卵巢静止奶牛血浆代谢谱分析

为研究卵巢静止奶牛与发情奶牛体内差异代谢物变化,选取产后60-90d的年龄、胎次、体况相近的健康经产高产奶牛作为实验动物。根据奶牛发情表现、直肠检查和B超检查及激素检测的结果,选取10头奶牛为发情组（A）,10头奶牛为卵巢静止组（B）,然后对两组奶牛血浆样品进行无偏性的1 H谱核磁共振检测,对比其血浆代谢组学图谱,进行多元统计分析,筛选及鉴定卵巢静止奶牛血浆差异代谢产物,并进行生物信息学分析。结果显示：相对于正常发情奶牛,卵巢静止奶牛血浆中共12种代谢产物表现异常,包括水平增加的乙酸、柠檬酸和酪氨酸,以及水平下降的低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、脂质、丙氨酸、丙酮酸、肌酸、胆碱、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱等;这些代谢产物与糖代谢、氨基酸代谢、脂蛋白代谢和胆碱代谢的异常密切相关;通过参与生物合成通路调节,干扰了奶牛正常卵泡生长。并且发现卵巢静止的奶牛血浆肌酸浓度降低和酪氨酸浓度升高的新变化。多种代谢异常提示奶牛卵巢静止与泌乳早期能量负平衡有关,并有伴发酮病和脂肪肝病的风险;另外,卵巢静止奶牛血浆肌酸、胆碱浓度降低和酪氨酸浓度升高的变化,为今后更为深入研究奶牛卵巢静止发生机制提供了新的方向。

集约化牛场奶牛低血钙症的防治效果

为查明不同防治方法对集约化牛场中低血钙症的防治效果。在某集约化牛场随机选取分娩当天实验奶牛120头,将其分为分娩当天组(Ⅰ组)和围产后期组(Ⅱ组),其中Ⅰ组实验奶牛在分娩后立即给药;Ⅱ组实验奶牛分别在产后第1、3、5、7天给药。结果显示:5%CaCl_2和5%葡萄糖能够降低分娩当天病率40%,降低围产后期低血钙症的发生率40%,博威钙能分别降低40%和35%,两种药物均能有效的降低低血钙症的发生;静注给药每头牛每年净利润为303.41元,投喂给药方法为256.91元。两种防治方法均可有效的降低奶牛低血钙症的发生,并会给牛场带来良好的经济效益,但是静脉输注方法经济效益更好。

基于SELDI-TOF-MS技术的奶牛乳热血浆蛋白质组学分析

奶牛乳热是围产期奶牛营养代谢性疾病,对于奶牛乳热在病理方面少有血浆蛋白质组学的研究。本研究目的是探究奶牛乳热在蛋白质组学层面的变化。试验21头患有奶牛乳热的奶牛和59头健康奶牛作为试验动物。试验通过SELDI-TOF-MS技术检验得到24个差异肽段的峰值,其中10个肽段经过Swissport Protein数据库搜索鉴定为10种差异蛋白。结果相对于对照组,乳热组中表达上调的蛋白4个;表达下调的蛋白2个;还有既表达上调又表达下调的蛋白4个。结论本次试验应用SELDI-TOF-MS技术鉴定了几个在奶牛发生乳热时表达的差异蛋白质。这些发现也为以后揭示奶牛乳热代谢性改变提供了依据。

引起奶牛乏情的疾病及其诊治方法

奶牛乏情是现阶段集约化奶牛场中常见的一种繁殖障碍性疾病,因奶牛乏情造成的经济损失逐年递增。本文对不同类型奶牛乏情的病因、诊断和治疗作以综述,旨在为临床上预防和治疗奶牛产后乏情提供理论依据。

基于GC/MS技术的产后卵巢静止奶牛血浆代谢谱分析

【目的】运用代谢组学中气相色谱/质谱联用技术(GC/MS)筛选卵巢静止奶牛和正常发情奶牛的血浆差异代谢物,探究奶牛发生卵巢静止时其体内代谢的变化。【方法】在黑龙江省某集约化牛场选取产后60—90 d,年龄、胎次、体况相近的经产高产奶牛为实验动物。根据奶牛的发情表现、直肠检查、B超检查及激素检测的结果,将奶牛分为发情组(A)22头和卵巢静止组(B)20头。应用GC/MS对两组奶牛的血浆样品进行检测得到其代谢组图谱,利用Chroma TOF软件对得到的峰图进行分析,得到原始数据。将标准化的GC/MS数据矩阵导入SIMCA-P+14.0软件包中,进行多元统计分析,先进行无监督的主成分分析PCA来观察各样本之间的总体分布和整个分析过程的稳定性,然后用有监督的(正交)偏最小二乘法分析(O)PLS-DA来区分各组间代谢轮廓的总体差异,找到组间的差异代谢物。为防止模型过拟合,采用七次循环交互验证和200次响应排序检验的方法来考察模型的质量。采用多维分析(O)PLS-DA和单维分析(t-test)相结合的办法,来筛选组间差异代谢物。在(O)PLS-DA分析中,变量权重值VIP>1的变量为差异变量;在t-test中,P<0.05的变量为差异变量。筛选VIP>1且P<0.05的代谢物作为差异代谢物,最后采用KEGG途径数据库对两组奶牛血浆样本进行代谢组学差异代谢物通路富集及互作网络构建分析。【结果】与正常发情奶牛相比,卵巢静止奶牛血浆中共有20种代谢产物表现异常,其中17种差异表达代谢物与奶牛卵巢静止的发生密切相关,包括水平增加的胆酸,水平下降的香草扁桃酸、烟酸甘氨酸、6-羟基烟酸、β-丙氨酸、L-酪氨酸、苯丙酮酸等,这些代谢产物参与了苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的生物合成,并参与了丙酸乙酯、烟酸烟碱、苯丙氨酸和酪氨酸的代谢,它们通过单一途径或综合途径对奶牛卵泡的正常生长产生干扰,从而引起卵巢静止。另外3种化合物亚氨基二乙酸、N-甲基-L-谷氨酸、3-氨基异丁酸可能与氨基酸代谢和细胞能量转运有关,其在奶牛卵巢静止中的生物学作用有待进一步证实。【结论】应用GC/MS技术有效的筛选出正常发情奶牛和卵巢静止奶牛之间的血浆差异代谢物,这些差异代谢物提示奶牛产后发生卵巢静止与体内多种物质代谢紊乱有关。这为今后深入探索奶牛产后卵巢静止的发病机理以及防治策略奠定了基础。

黑龙江省某猪场散发慢性猪瘟的诊断

猪瘟是由猪瘟病毒引起的猪的一种急性或慢性、热性和高度接触性传染病。近年,由于普遍采取疫苗接种等预防措施,猪瘟流行形式发生了变化,呈散发性流行。2015年10月,黑龙江八一农垦大学兽医院接到来自大庆某猪场的3头发病猪,根据发病情况、临床检查、剖检病理变化及RT-PCR检测结果,最终确诊为慢性猪瘟。

奶牛乳热和亚临床低钙血症的研究概况

乳热和亚临床低钙血症是围产期奶牛最重要的常量矿物质代谢紊乱性疾病。围产期奶牛会经历泌乳过程,这个过程中动物自身的矿物质平衡很可能会失衡,从而导致乳热和亚临床低钙血症的发生。就奶牛生产性疾病来说,乳热与许多其他疾病的发生有关,它可以作为诱发因素引起围产期奶牛疾病的级联事件。本研究概括了乳热和亚临床低钙血症可能会引发的生理和临床后果,为临床预防及治疗乳热和亚临床低血钙症提供理论基础。

奶牛低血钙症与其他疾病的关系

随机选取分娩当天（0d，31头）、围产后期（产后14-21d，25头）、泌乳早期（产后50-60d，39头）、泌乳中期（产后120-150d，40头）和泌乳后期（产后200-220d，40头）的奶牛为试验动物，调查和记录{临床各类资料并检测血钙浓度。结果显示，5个时期奶牛的低血钙症发生率分别为90％，64％，41％，25％和43％，分娩当天发病率最高；分娩当天患低血钙症奶牛随后易患繁殖疾病、乳房炎、肢蹄病、消化系统疾病和酮病，发病率分别为33．33％，22．22％，20．37％，9．26％和14．81％，淘汰率为41％。表明该牛场低血钙症较为多发，并易引发其他疾病，淘汰率较高。

奶牛酮病早期预警指标的确立与评估

为了早期预测奶牛酮病的发生，在黑龙江省东、西部2个集约化牛场（均有250多头泌乳牛）随机选取产前15—2d，分娩当天，产后2—15d的奶牛为试验动物。通过检测试验牛血浆中葡萄糖（Glu）、β-羟丁酸（BHBA）和游离脂肪酸（NEFA）的浓度，了解产后奶牛酮病发生状况；通过检测试验牛产前和产后各肝功指标，阐明奶牛围产期肝功指标与酮病间的关系以及对产后酮病发生风险的预警作用。结果表明：酮病发病率在东部牧场为40％，在西部牧场为45．16％；两牧场产后奶牛的血浆谷草转氨酶（AST）、NEFA和BHBA的水平均显著高于产前奶牛并与酮病呈显著正相关，血浆Glu水平显著低于产前奶牛并与酮病呈显著的负相关。根据受试者工作特征曲线（ROC）分析确定了东部牧场的预警值为产前血浆AST〉69．5U／L、G1u〈4．16mmol／L、NEFA〉0．25mmol／L、BHBA〉0．32mmol／L。西部牧场预警值为血浆AST〉68．0U／L、Glu〈3．97mmol／L、NEFA〉0．27mmol／L、BHBA〉0．43mmol／L。结果显示，奶牛产前血浆NEFA、Glu、AST和BHBA指标超过预警值可作为奶牛发生酮病的早期风险预测依据。

奶牛低血钙早期预警指标的确立与评估

为了早期预测奶牛分娩时发生低血钙症的可能性，本试验在黑龙江省A和B两个集约化牛场（均有250多头泌乳牛）随机选取产前15～2d和分娩当天奶牛作为实验动物。通过检测试验奶牛分娩当天组血浆钙浓度，明确分娩奶牛低血钙症发病率；通过检测试验奶牛产前和分娩当天血浆中镁离子（Mg^2＋）、钾离子（K^＋）和无机磷（P^3＋）的浓度，阐明奶牛产前血浆中各离子水平与低血钙症的关系，对产后低血钙症发生风险起到预警作用。结果显示：产后低血钙症在牧场A的发病率为90．32％，在牧场B为86．67％；两牧场产前奶牛与分娩当天奶牛的血浆P^3＋、K^＋、Mg^2＋差异极显著，血浆P^3＋、Mg^2＋水平与血钙水平呈显著的正相关，血浆K^＋水平与血钙水平并没有显著的相关性。根据受试牛工作特征曲线（ROC）分析确定了牧场A产前预警值为血浆Ca^2＋〈2．11mmol／L，敏感度为100％，特异度为88．2％；血浆P^3＋〈1．83mmol／L，敏感度为75．0％，特异度为82．4％。牧场B产前预警值为血浆Ca^2＋〈2．12mmol／L，敏感度为98．7％，特异度为88．5％；血浆P^3＋〈1．90mmol／L，敏感度为98．7％，特异度为65．4％。结论：奶牛产前血浆Ca^2＋和P^2＋浓度超过预警值口丁作为奶牛产后低血钙发生的早期风险预测依据。

基于1H核磁共振技术的产后乏情奶牛血浆代谢组学分析

目的应用1H核磁共振（1H nuclear magnetic resonance,1H NMR）技术筛选正常发情奶牛与乏情奶牛血浆中差异表达的代谢物,初步揭示奶牛产后乏情与代谢变化的关系。方法选取年龄、体况、胎次相近的产后60-90 d经产荷斯坦奶牛206头,结合临床表现、直肠检查、B超检查和激素检测结果筛选出发情组（20头）和乏情组（24头）共计44头为实验动物。应用1H NMR技术对两组奶牛血浆代谢物进行检测,并结合多元统计分析,筛选出两组奶牛血浆中差异代谢物。结果与发情组相比,筛选出的10种差异表达代谢物,即L1[LDL,脂类（低密度脂蛋白）]、L2[VLDL,脂类（极低密度脂蛋白）]、L3（Lipid,脂质）、丙氨酸（Ala）、谷氨酸（Glu）、天冬酰胺（Asn）、肌酸（Crea）、胆碱（Choline）、磷酸胆碱（PC）和甘油磷酸胆碱（GPC）,在乏情组奶牛血浆中均表达下调,其参与了能量、氨基酸、脂类以及胆碱等代谢途径。结论筛选出表达下调的差异代谢物,可能导致奶牛处于能量负平衡、脂类代谢异常或脂肪肝状态,从而干扰生殖激素合成与分泌,引发奶牛产后乏情。

奶牛亚临床低血钙症的蛋白质组学分析

根据奶牛血浆钙浓度将奶牛分为试验组和对照组,并设置2个平行试验组。应用iTRAQ/LC-MS/MS技术对2组奶牛样品进行差异表达蛋白的筛选和鉴定,并结合生物信息学软件对试验结果进行分析。试验共得到398个差异表达蛋白,其中2个平行试验组重叠的蛋白为265个,经过筛选共得到14种具有统计学差异的表达蛋白。结合生物信息学分析中的基因功能分析,结果得到74个注释结果,细胞组成、分子功能和生物过程分别为6,12,55个。根据结果分析可知,奶牛亚临床低血钙症生理和病理现象能够从3个方面解释其生理和病理现象,分别是血钙调节、免疫与炎症反应和血液凝固与补体途径。本试验首次应用iTRAQ结合LC-MS/MS技术对亚临床低血钙症奶牛进行蛋白质组学分析,填补该技术对亚临床低血钙症的空白,并提供科学依据。

血液能量平衡指标对高产奶牛产后卵巢静止的影响

本试验旨在确立能量平衡对奶牛产后卵巢静止的作用，为今后预防该病提供科学依据。从黑龙江省某集约化牛场随机选取产后14～21d奶牛80头（年龄2～4岁，胎次1～3次，泌乳量（34．82±9．51）kg／d），跟踪观测至产后60～90d，进行奶牛发情鉴定，结合B超观察与生殖激素检测从观测奶牛中选出卵巢静止与发情奶牛各16头。对2组奶牛产后14～21d和60～90d的血浆能量代谢及肝功能指标进行了统计比较。结果显示：产后60～90d卵巢静止奶牛血浆8-羟丁酸和游离脂肪酸含量高于发情奶牛（P〈0．05），血浆促卵泡素、雌二醇和孕酮浓度极显著低于发情奶牛（P〈0．01）；根据受试者工作特征曲线分析确定产后14～21d血浆β-羟丁酸〉0．69mmol／L、游离脂肪酸〉0．52mmol／L作为产后卵巢静止预警值，灵敏度和特异度分别为85．7％和83．30％，92．3％和86．70％，产后60～90d2项指标的预警值分别为0．42，0．17mmol／L。奶牛产后14～21d与60～90d血浆β-羟丁酸和游离脂肪酸浓度超过预警值，奶牛产后发生卵巢静止的风险会增大。

应用蛋白质组学筛选能量负平衡卵巢静止奶牛生物标记物

目的运用蛋白质组学技术筛选能量负平衡卵巢静止奶牛的生物标记物,建立早期诊断标准,并探讨其发病机制。方法应用荧光差异双向凝胶电泳(fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis,2D-DIGE)和基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/lonization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS),鉴定能量正平衡发情奶牛和能量负平衡卵巢静止奶牛的差异蛋白质。采用生物信息学、蛋白印迹和受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析差异蛋白质,并确定用于早期诊断卵巢静止的生物标志物。结果两组奶牛筛选出12种差异表达蛋白,这些差异蛋白主要参与脂类代谢、维生素代谢、补体凝血级联及过氧化物酶增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor-α,PPAR)信号通路,其中α-1-微球蛋白/bikunin前体(alpha-1-microglobulin/bikunin precursor,AMBP)可作为卵巢静止早期诊断的标志物,预警值为4 346.75 ng/L。结论应用蛋白组学筛选出能量负平衡导致奶牛卵巢静止的12种差异表达蛋白,确定了用于早期诊断卵巢静止的生物标志物,为卵巢静止的临床诊断和发病机制奠定了基础。

基于Actinomyces ruminicola的微生态制剂对瘤胃发酵的影响

目的探讨基于Actinomyces ruminicola的微生态制剂对瘤胃发酵的影响。方法将分离得到的能生成挥发性脂肪酸（volatile fatty acid,VFA）的瘤胃厌氧菌Actinomyces ruminicola（命名为NY2,以下简写为Ar）与痤疮丙酸杆菌（以下简写为Pa）按3种比例混合制成微生态制剂（M1：Ar∶Pa=2∶3;M2：Ar∶Pa=1∶1;M3：Ar∶Pa=3∶2）,进行羊体内发酵试验,分别于饲喂后0、2、4、6、8、10、12和24 h无菌采集各组羊的瘤胃液,用精密p H检测仪测定瘤胃液的酸碱度;Waters2695液相色谱仪测定瘤胃液中VFA（主要是乙酸、丙酸和丁酸）的含量。结果各组瘤胃液的p H值均呈先下降后升高的趋势;M2组瘤胃液的p H值与M1和M3组差异有统计学意义（P均〈0.05）。当微生态制剂中Ar∶Pa=1∶1,饲喂4-6 h后,瘤胃液中乙酸、丙酸、丁酸和总VFA的浓度均达最高,分别为（82.49±2.51）、（35.12±1.69）、（22.92±1.02）和（139.81±5.61）mmol/L,该比例的微生态制剂可保持瘤胃内容物p H在6.0-7.0之间波动。结论本实验制备的微生态制剂有利于瘤胃微生物发酵,能促进乙酸、丙酸等VFA的生成,为今后该瘤胃微生态制剂的应用奠定了基础。

围生期奶牛低钙血症与TRAP-5b的关系研究进展

奶牛低钙血症是奶牛围生期矿物质代谢紊乱性疾病。奶牛骨骼中含有的钙约占机体钙含量的99%。低钙血症可引起一系列代谢障碍性疾病,这些疾病发病率高,会给养殖者造成巨大的经济损失。随着对奶牛低钙血症研究的不断深入,研究者们发现产前骨钙动员、破骨细胞的活性增强与产后低钙血症有显著的相关性。作为破骨细胞和骨吸收的标志物,抗酒石酸酸性磷酸酶-5b（TRAP-5b）等骨代谢生化标志物在围生期奶牛血浆中有明显的变化。因此,笔者查阅了大量文献,概述了奶牛低钙血症与骨代谢生化标志物TRAP-5b的关系及其研究进展。

基于Actinomyces ruminicola的微态制剂的体外发酵效果

为了研制一种新的微生态制剂,试验利用分离得到的瘤胃厌氧菌Actinomyces ruminicola(命名为NY2)与痤疮丙酸杆菌混合制成微生态制剂进行体外发酵,研究微生态制剂的体外发酵特性及产挥发性脂肪酸的能力,确定微生态制剂中Actinomyces ruminicola与痤疮丙酸杆菌的最佳混合比例。结果表明:当微生态制剂中Actinomyces ruminicola与痤疮丙酸杆菌混合比为1∶1时,培养瓶中乙酸、丙酸、丁酸和总挥发性脂肪酸的浓度最高值分别达到91.07,41.12,27.58,169.19 mmol/L。该比例微生态制剂可保持瘤胃内容物pH值在6.0左右波动,有利于瘤胃微生物发酵,并能促进乙酸、丙酸等挥发性脂肪酸的生成。

奶牛真胃左方变位手术前后血液生化参数的变化

为了解奶牛真胃左方变位(LDA)手术前后血液生化指标的变化,跟踪采集了100头围产期奶牛产后7、14、21和28 d尾静脉血液,后经确诊6例LDA患牛进行手术整复,并随机选择6头相应的健康牛为对照。通过检测12头牛手术前后1周血清中游离脂肪酸(NEFA)和β-羟丁酸(BHBA)等21项生化指标,调查患LDA奶牛机体能量代谢、肝功能和电解质状况,并分析手术前、后生化指标的变化。结果显示:术前多数患LDA奶牛机体能量负平衡指标升高,肝功能指标不同程度的升高,电解质变化不一;术后牛机体能量代谢指标多数恢复正常,肝功能指标部分恢复正常,部分仍升高,电解质多恢复正常。

系统兽医学方法的代谢组学技术在围产期奶牛疾病中的应用概况

系统兽医学方法是继简化法之后又出现的一种用来解决动物健康问题的新方法。由于简化法未能解决围产期奶牛的很多疾病,最终建立起了系统兽医学方法,其包括基因组学、蛋白组学、转录组学、代谢组学在内的4个不同层面的组学技术,现主要概述代谢组学技术在围产期奶牛疾病中的应用。