蜡状芽孢杆菌Bc-05菌株纤溶酶的酶学性质

对蜡状芽孢杆菌Bc-05菌株的发酵上清液经硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析所获得的纤溶酶进行性质研究.结果表明:经纤维蛋白平板法检测该酶有直接水解纤维蛋白和激活纤溶酶原的双重作用,最适作用温度37℃,最适pH=8.0,在pH=8.0条件下25℃和37℃放置24 h酶活力仍保持77.52%和78.96%,该酶体外对兔血凝块有明显的溶解作用;Ca2+,Mn2+离子对该酶具有激活作用,而Cu2+,Fe3+完全抑制其纤溶活性,PMSF,EDTA和DTT对该酶有抑制作用,说明活性中心含有二硫键、金属离子和丝氨酸;测其N端10个氨基酸序列为NH2-Val-Thr-Pro-Thr-Asn-Ala-Val-Asn-Thr-Gly,与其他生物来源的纤溶酶相比较没有同源性.

延胡索纤溶酶的分离纯化及部分性质

目的 从延胡索（Rhizoma corydalis）中分离纯化具有溶解纤维蛋白活性的单体蛋白单一组分，并对粗酶性质做初步研究。方法利用硫酸铵分级沉淀和阴离子交换色谱从延胡索中纯化纤溶酶。结果从延胡索中纯化出两种纤溶酶，表观相对分子质量分别为33000和59000。粗酶用丝氨酸蛋白酶抑制剂鉴定为丝氨酸蛋白酶，ED-TA对酶活没有抑制作用。延胡索纤溶酶粗酶体外溶纤性质主要表现为激酶活性，在4～50℃活性稳定，50～75℃酶活有所下降；最适pH值为8．0，在pH3、0左右，仍能保留大部分酶活；能抵抗胰蛋白酶水解和胃蛋白酶的作用。结论延胡索纤溶酶性质稳定，有希望研发成为一种溶栓新药。

转脂蛋白CaMBP10的胶体金标记及对白菜中CaMBP10结合蛋白的鉴定

植物转脂蛋白(LTP)是一类广泛存在于高等植物中的空间结构高度保守的碱性小分子蛋白,其确切功能和调节机制至今仍不清楚.本室从白菜中分离的钙调素结合蛋白10(CaMBP10),经序列分析被鉴定为植物转脂蛋白家族成员.近期研究结果表明,CaMBP10参与了植物的生物与非生物胁迫反应.为了深入探讨CaMBP10的抗性机制,确定植物中与其相互作用的蛋白质,本文拟建立胶体金标记CaMBP10的方法,通过凝胶覆盖分析,检测植物样品中的CaMBP10结合蛋白.为此,对标记反应的最适条件进行了优化,确定最佳条件为:交联剂戊二醛用量为0.034%,交联反应pH值为7.0,交联反应时间为40 min,胶体金颗粒度为10 nm,胶体金溶液的pH为7.0.本文确定建立了植物样品中CaMBP10结合蛋白的分析与鉴定方法.

白菜转脂蛋白CaMBP10分子中钙调素结合结构域的鉴定

植物转脂蛋白(LTPs)是多基因编码的蛋白家族,广泛分布于高等植物,其确切的生理功能至今仍不清楚.本室从白菜中分离的钙调素结合蛋白-10(CaMBP10)经序列分析被鉴定为植物转脂蛋白家族成员,体外实验证明钙调素(CaM)调节其脂质结合活性.为了深入了解转脂蛋白与CaM的相互作用机制,本文通过删除、缺失和定点突变等分子生物学手段确定了白菜转脂蛋白CaMBP10分子中的钙调素结合结构域.该结构域位于分子C末端64～83位氨基酸残基之间,其中疏水氨基酸的分布具有1-5-8-10的CaM结合模序特征.

瓜蒌纤溶酶的分离纯化及性质研究

利用亲和层析从瓜蒌蛋白粗提液中分离纯化得到一纤溶酶,并对其部分酶学性质进行研究。结果表明,该酶表观分子量为66.0kD;最适pH值为9.0;在4～40℃活性无明显变化,78℃以上完全失活;在以酪蛋白为底物的水解反应中,温度、酶底物比、pH值、反应时间4种因素对水解反应的影响力大小为:温度>酶底物比>反应时间>pH;Km值为1.89mg/mL,Vmax=555.56μmol/(L·min)。

早园竹叶绿体atpA基因序列及系统进化分析

在构建叶绿体DNA基因组文库的基础上,克隆了早园竹叶绿体atpA基因,与禾本科水稻、玉米等11种植物atpA基因的SNP对比分析发现,早园竹与供试禾本科植物叶绿体atpA基因序列间共有110个SNP位点,其中与水稻Indica,Japonica和野生稻之间仅有1个SNP位点;与玉米、高粱、甘蔗及杂交甘蔗之间有2个SNP位点;而与小麦、大麦、匍茎剪股颖和黑麦草之间的SNP位点较多。基于atpA基因序列和编码氨基酸序列构建的Neighbor-joining系统进化树显示,供试的禾本科植物在系统进化上可划为2个进化类群和4个进化亚群,水稻与早园竹处于同一亚群。表明早园竹在进化关系上与水稻最近,其次与甘蔗、玉米和高粱进化关系较近,而与麦类及其近缘植物的进化关系较远。

大丽轮枝菌颉颃细菌2-14菌株的鉴定

从棉田土壤中筛选出具有棉花黄萎病病原菌——大丽轮枝菌颉颃活性的2-14菌株,经菌落和菌体形态观察、生理生化鉴定以及16S rDNA鉴定,该菌株为Bacillus velezensis。抑菌谱试验说明,2-14菌株对几种植物病原菌都有抑制作用,有较高研究价值。

食堂越冬家蝇体表携带细菌的初步研究

采用稀释涂布平板法和构建16S rDNA文库法,对越冬家蝇体表携带的细菌数量和种类进行了分析。通过培养计数发现越冬家蝇（Musca domestica）体表携带细菌数量较少,每头越冬家蝇体表携带的细菌数量居于5×104~1.2×105之间。对随机挑选的987个16S rDNA文库克隆进行了测序,通过16S rDNA序列比对分析发现：88.6%的测序克隆为细菌,共检测出32种细菌,其中大肠埃希氏菌（Escherichia coil）、小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）、阴沟肠杆菌（Enterobactercloacae）,肠道沙门氏菌（Sal monellaenterica）4种人畜肠道菌分别占检出率的13.6%、1.9%、3.3%和1.5%,说明越冬家蝇体表携带细菌主要来源于人畜粪便;同时还检出结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）、口腔纤毛菌（Leptotrichia buccalis）、支气管炎博德特菌（Borde-tella bronchiseptica）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）和痤疮丙酸杆菌（Propionibacteriumacnes）等致病菌和条件致病菌。

组蛋白激活拟南芥CDPK催化CaMBP10的体外磷酸化反应

植物转脂蛋白(plant lipid transfer proteins,LTPs)是高等植物中广泛存在的多基因编码的小分子碱性蛋白.本研究室已经证明白菜和豌豆LTPs可分别被内源胞浆可溶性和膜结合钙依赖性蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase,CDPK)磷酸化.为深入研究CDPK对白菜钙调素结合蛋白10(calmodulin-binding protein-10,CaMBP10)的磷酸化性质及特征,本文从拟南芥可溶性蛋白粗提物中检测到1个分子量约为54 kD的CDPK对CaMBP10有磷酸化作用.研究表明,组蛋白可增强CDPK对CaMBP10的磷酸化活性,促进磷酸化进程.而且组蛋白和Ca2+对CDPK具有协同调节效应,二者共同作用时比Ca2+单独作用时,激酶的活力增强约12倍.此外,不同组蛋白对CDPK的激活能力不同,组蛋白1对该激酶活性的激活能力要比组蛋白3高约8倍.

结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的快速分子诊断方法构建

目的 采用快速分子诊断方法中TaqMan荧光定量PCR技术,应用于利福平和异烟肼一线抗结核药物耐药基因的诊断中,评价其性能,建立高灵敏度、高特异度、高准确性并且快速的筛查方法,为结核分枝杆菌耐药性的诊断和治疗提供依据并探讨其应用价值,努力改善耐药结核病的检测和可行性。方法 本研究针对利福平ropB基因531位点突变和异烟肼katG基因315位点突变的特点,设计TaqMan-MGB引物和探针,通过反应条件优化,建立TaqMan荧光定量PCR方法;用克隆到pUC57载体上的阳性标准品及不同菌株评价该方法的特异性、灵敏度、重复性和精密度,采用甘油三酯、胆红素和血红素进行了干扰性实验。结果 TaqMan荧光定量PCR方法的检测限可达10copies/μl;在交叉干扰实验中,检测了5种常见呼吸道感染细菌国家标准菌株,均未检出,基因野生型和突变型探针特异性较好,不受其它基因干扰;批内、批间的CT值变异系数均小于5%,标准曲线R2=0.998,扩增效率均在90%以上;该反应迅速,检测时间为1h。结论 本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法有助于及时发现结核分枝杆菌耐药情况,对结核病的耐药检测与后续治疗具有重要意义。

多重组等温聚合酶快速扩增技术在新冠病毒检测中的应用

目的探讨多重组等温聚合酶快速扩增技术(MIRPA)在新冠病毒检测中的应用价值。方法从GenBank数据库下载新冠病毒基因核苷酸序列,选取保守区域ORF1ab基因作为扩增对象,设计MIRPA检测的特异性引物。通过引物筛选、反应体系优化,建立检测新冠病毒的MIRPA方法,用建立的MIRPA方法检测人类冠状病毒OC43(HCoVOC43)、HCoV-229E、流感病毒B型(FluB)阳性咽拭子样本,评估其特异性;和实时荧光定量PCR检测结果比较,评估其准确度。结果针对新冠病毒ORF1ab基因序列设计合成引物和探针,建立MIRPA检测体系。用优化的MIRPA体系检测新冠病毒阳性参考品均为阳性,HCoV-OC43、HCoV-229E、FluB均为阴性;MIRPA方法的灵敏度为100拷贝/ml;和实时荧光定量方法的检测结果符合率达100.00%。结论建立的MIRPA方法检测新冠病毒的特异性强、灵敏度高,结果准确可靠,具有重要的经济和社会价值。