德州驴HO-1基因生物信息学分析及多克隆抗体制备

【目的】克隆德州驴血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)基因,对其进行原核表达及多克隆抗体制备,同时检测HO-1基因在德州驴不同组织中的表达情况,为后期研究HO-1基因功能提供支撑材料。【方法】参考GenBank中公布的马HO-1基因序列(登录号:XM_023631135.1)设计特异性引物,从驴原代肺泡巨噬细胞(donkey primary alveolar macrophages,DPAMs)中提取RNA,反转录为cDNA后进行PCR扩增HO-1基因编码区(coding sequences,CDS),对测序所获序列与其他物种进行相似性比对并构建系统进化树;应用多种在线软件对HO-1基因编码蛋白进行生物信息学分析。将HO-1基因序列克隆至pCold-SUMO载体进行原核表达,经镍柱亲和层析纯化后,以重组的HO-1蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,利用ELISA和Western blotting检测多克隆抗体特异性及与抗原结合的最大稀释度。利用免疫组化试验检测德州驴4种组织中HO-1蛋白的表达水平。【结果】德州驴HO-1基因CDS区全长873 bp,编码290个氨基酸,其氨基酸序列与马的相似性最高,亲缘关系最近,与鸡的相似性最低,亲缘关系最远。德州驴HO-1蛋白是一种不稳定的亲水性蛋白,分子质量为33.04 ku,无信号肽,存在1个跨膜区,二级结构以α-螺旋为主。ELISA、Western blotting结果显示,针对HO-1制备的多克隆抗体与HO-1结合最大的稀释度为1∶102400,宿主HO-1蛋白可被制备的多克隆抗体识别。免疫组化结果显示,德州驴4种组织中均有效表达HO-1蛋白。【结论】本研究成功获得德州驴HO-1重组蛋白,并制备特异性多克隆抗体,为后续深入探究HO-1基因在马属动物感染病原过程中的作用提供参考依据。

马疱疹病毒8型gD蛋白的生物信息学分析及多克隆抗体制备

旨在探索马疱疹病毒8型(Equine herpesvirus type 8,EHV-8)囊膜蛋白gD的生物信息学特性、原核表达和多克隆抗体制备。用生物信息学分析软件对gD基因编码蛋白质的理化性质、亲/疏水性和跨膜区进行分析,以EHV-8 SDLC66毒株为模板,通过PCR扩增gD蛋白的胞外区并克隆至pET-32a(+)载体中,将重组质粒pET-32a-gD转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,收集菌体超声破碎,纯化并获得重组gD蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,用间接ELISA测定所制备多克隆抗体的效价,同时用Western blot与间接免疫荧光试验(IFA)明确所制备多克隆抗体的特异性。结果表明,EHV-8 gD编码的蛋白稳定,是亲水性蛋白,有跨膜区,位于30-330 aa。gD蛋白跨膜区正确克隆入pET-32a(+)载体,获得重组质粒pET-32a-gD。重组gD蛋白在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,分子质量约为55 ku,将其纯化后免疫新西兰兔获得抗gD多克隆抗体,该抗体的效价高达1∶200 000,Western blot与IFA结果表明该多克隆抗体具有良好的特异性。

噬菌体防治ETEC感染小鼠效果的初步研究

为研究噬菌体防治产肠毒素大肠杆菌(ETEC)感染小鼠的效果,本研究通过双层平板法测定噬菌体DS2的效价,并利用双层琼脂空斑试验分别检测噬菌体DS2对致仔猪腹泻大肠杆菌K88、K99及987p的体外裂解作用。结果显示,噬菌体DS2的效价为6.9×10^(9)pfu/mL,且均能裂解上述3种ETEC。进一步经小鼠试验评估噬菌体在体内防治ETEC感染的效果:将噬菌体分别以2×10^(8)pfu/只(高剂量组)、2×10^(7)pfu/只(低剂量组)经腹腔注射接种小鼠,1 h后再经腹腔注射0.2 mL剂量均为3×10^(8)cfu/只的K88、K99及987p混合菌液。分别于感染后12 h、24 h、48 h无菌采集各组小鼠的肝脏,采用平板计数法检测各组小鼠肝脏载菌量;利用双层平板法检测各组小鼠肝脏中的噬菌体含量。感染后24 h,利用ELISA试剂盒检测各组小鼠血清中细胞因子IL-1β含量。感染后48 h,利用内毒素检测鲎试剂盒测定各组小鼠血浆内毒素的含量。小鼠肝脏载菌量和噬菌体含量检测结果显示:与接种LB肉汤的对照组相比,高、低剂量组小鼠的肝脏载菌量在感染后不同时间有升有降,但二者之间或者与对照组之间均无显著差异(P>0.05);随着感染时间的延长,高、低剂量组小鼠肝脏噬菌体的含量均在下降,且在感染后低剂量组小鼠肝脏噬菌体的含量极显著高于(感染后24 h)(P<0.01)或者高于(感染后48 h)高剂量组。IL-1β及内毒素检测结果显示,与对照组相比,高、低剂量组小鼠血清中IL-1β的含量显著下降(P<0.05)或者下降,但高、低剂量组小鼠血浆内毒素的含量均升高或显著升高(P<0.05)。将60只小鼠按照上述实验分组及处理,观察并记录感染后72 h内各组小鼠的发病率和死亡率,并统计感染后不同时间每组小鼠的平均体况得分。结果显示,对照组小鼠在感染接近24 h后体况计分降至25分以下,高、低剂量组小鼠在感染24 h后体况计分下降至70分及90分以上。高、低剂量组及对照组小鼠的存活率分别为65%、95%及15%。以上结果表明,DS2噬菌体可有效防治体内外ETEC的感染,且低剂量DS2噬菌体的疗效总体上要优于高剂量。本研究为防治仔猪大肠杆菌病提供了新思路。

马疱疹病毒8型荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

马疱疹病毒8型(EHV-8)是近年来在规模化养驴场发现的一种病毒,其主要导致马属动物呼吸困难、繁殖障碍(流产、产弱驹等),严重危害养驴业的健康发展。为建立EHV-8的分子生物学检测方法,用于该病原感染的流行病学调查和致病机制研究,根据NCBI数据库中EHV-8参考毒株ORF 70基因序列的高度保守区域,设计特异性引物,优化程序,建立检测EHV-8的荧光定量PCR方法。结果表明,该方法灵敏度高,最小检测浓度为100拷贝/μL,灵敏度是常规PCR的100倍;特异性强,与EHV-1、EHV-4均无交叉反应;重复性好,组内和组间重复试验变异系数分别为0.15%~0.83%和0.06%~0.47%。利用新建立的方法对120份临床驴血样本进行检测,阳性检出率为32.5%,研究结果为EHV-8的检测和致病性研究提供了可靠的技术支撑。