香菇顺式调控元件的克隆及其序列分析

应用顺式调控元件探测载体G221构建了一个香菇Lentinula edodes基因组文库。G221为大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体,含有一个由酵母Cyc1基因基本启动子控制的lacZ标记基因,能以转录增强活性筛选香菇DNA片段。用这个基因组文库转化酵母菌,获得了一批lacZ阳性转化子。对其中表达较强的阳性转化子进行质粒抽提和双酶切鉴定,筛选到50个香菇顺式调控元件DNA片段。对其中部分片段进行了测序,并对其中一个序列进行了序列分析,鉴别了该序列上的几个与转录相关的特征序列。该研究也探讨了利用酵母表达系统克隆香菇顺式调控元件的可行性。

利用SMART技术构建海带配子体cDNA文库

用Trizol试剂提取海带配子体总RNA，用SMARTcDNA文库构建试剂盒构建cDNA文库。经测定原始文库滴度达到1．1×10^8Pfu／ml，文库有500m体积，库容量为5．5×10^7Pfu，通过PCR检测，文库的重组率达100％，扩增出的片段主要集中在0.8—1.8kb，平均插入片段长度约为1．34kb。这些数据表明，已获得高质量的海带cDNA文库，为海带基因资源保存及新基因的克隆奠定了基础。

微囊藻毒素ELISA检测方法的建立与评估

采用制备的微囊藻毒素(MC-LR)单克隆抗体制备包被抗原,建立MC-LR的ELISA检测方法。该方法定量检测区间LQD为0.20~4.00μg/L,最低检测限LOD为0.10μg/L,最高检测限HOD为8.00μg/L,最佳包被抗原浓度为0.5μg/m L,对应抗体稀释度为1∶20 000左右,酶标二抗工作稀释度选择为1∶6 000;应用该方法对加标水样进行检测,综合回收率为(98.0±10.7)%,各样品检测结果变异系数均小于10%。该ELISA方法准确度良好,精密度优良。

香菇对潮霉素的抗性实验

选用4株不同品系的香菇菌种,比较了香菇在固体、液体2种不同培养条件下,对潮霉素抗性的差异;研究了香菇以原生质体、原生质体再生菌丝、冷藏菌种等3种不同生理状态为实验材料,对潮霉素的抗性特点。试验表明,香菇对潮霉素极为敏感,在固定的条件下,抗性稳定;而当条件改变时,抗性有一定变化。

当前我国农业科技推广的几种模式

目前我国农业科技推广方式有政府和民间组织两种,政府扶持的科技推广是目前我国农业科技转化主渠道,在不同的条件下应采用不同的新技术推广模式。农业科技推广主要模式有:官产学合作模式、农业科技推广体系模式、科技示范工程及示范园地模式、公司+农户模式、农业合作社模式等。

前沟藻18S rDNA序列克隆和分子鉴定分析

旨在扩增一株未知微藻18S rDNA,并进行序列分析和物种鉴定分析。提取该微藻总DNA,用PCR技术扩增其18S rDNA,对序列进行测序,在GenBank进行序列比对分析,用Clustal X软件构建进化树;用光学显微镜进行形态学分析。经测序其序列长度为1 736 bp,G+C为47%;同源性分析表明,与GenBank中多个强壮前沟藻种的18S rDNA基因序列同源性达99%;与前沟藻属的其它藻种同源性均达95%以上。而与裸甲藻属和环藻属的藻株同源性为85%左右。经光学显微镜观察,该藻具有典型的强壮前沟藻形态。结合该藻18S rDNA序列分析和粗略的形态学分析,推断该藻可能为前沟藻属的强壮前沟藻。微藻形体微小,结构简单,需借助电子显微镜才可准确地从形态学上鉴定其种属,鉴定工作繁琐费时;而利用分子技术,则可能使鉴定工作变得简单快捷。

抗大田软海绵酸单克隆抗体的制备及免疫学特性分析

目的制备了赤潮毒素大田软海绵酸(okadaic acid,OA)单克隆抗体,并分析其免疫学特性。方法用人工抗原大田软海绵酸-小牛血清蛋白偶联物(OA-BSA)免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术经初筛、复筛和亚克隆,筛选到1株可稳定分泌抗OA单克隆抗体的杂交瘤细胞株3H4。对抗体效价、亚型、特异性、敏感性进行免疫学鉴定与分析。结果抗体亚型为IgG2b;腹水效价为1∶1.28×106;50%抑制质量浓度为2.852 ng/ml;最低检测限为0.45 ng/ml;电泳结果显示抗体,由1条重链和1条轻链组成;与OA同系物PTX1、GYM、SPT1、YTX交叉反应率为0。结论制备的OA单抗效价和特异性均较好,可用于OA的免疫学检测。

抗腹泻性贝毒软海绵酸胶体金免疫快速检测技术研究

采用自制的腹泻性贝毒软海绵酸（okadaic acid,OA）单克隆抗体与BSA偶联物为胶体金标记底物研究OA胶体金免疫检测技术。制备了各种粒径的胶体金,最终确定粒径30 nm的胶体金作为标记抗OA单克隆抗体效果最佳;制备了半抗原OA与BSA的偶联物,将偶联物包被在硝酸纤维素膜上作为检测带,以羊抗鼠Ig G作为质控带,依据免疫竞争法原理,建立了快速检测OA的免疫层析试纸条方法,该方法在3~5 min即可目测判断结果,灵敏度为6.25 ng/m L;依据工艺流程,发明制备了软海绵酸OA的免疫层析快速检测卡,该卡检测样本中的OA含量阈值为6.25 ng/m L。

食用菌分子转化研究状况

概述了食用菌转化取得的进展和存在的问题,详细介绍了筛选标记、启动子、转化方法、整合方式以及将来的研究方向等方面的研究状况。筛选标记主要有营养缺陷型、药物抗性标记;启动子主要是同源启动子ras基因和gpd基因启动子;转化方法主要有PEG法、电击法、限制性内切酶介导法、农杆菌介导法,对比分析了各种方法的优缺点;重组方式主要是多位点整合;甲基化是导致转录水平低的一个原因;可能的提高转化率措施有采用强启动子、加入同源片段进行同源整合。

抗微囊藻毒素单克隆抗体的制备与鉴定

构建了微囊藻毒素(Microcystin-LR,MC-LR)完全免疫原MCLR-KLH,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗MCLR单克隆抗体,用间接竞争ELISA方法筛选抗体。经过3次克隆,获得2株可稳定分泌抗MCLR单克隆抗体的杂交瘤细胞株,腹水效价达1:8?104;IC50为0.81 ng?m L?1,最低检测限0.10 ng?m L?1,亲和常数3.8?108 L?mol?1,电泳结果显示抗体由1条重链和1条轻链组成,与MC-LR同系物MC-RR、MC-YR有较强的交叉反应,与MC-LW有弱交叉性反应,与河豚毒素无交叉反应。实验结果表明该抗体质量较好,将在微囊藻毒素的快速检测、产生机理等方面具有较大的科研和应用价值。

GUS基因瞬时表达检测香菇顺式因子的调控功能

设计了一个顺式元件功能检测载体pYF3553,该载体以GUS为报告基因,其上游连接一段由待测香菇(Lentinula edodes)克隆片段与酵母Cyc1基本启动子组成的杂合启动子。将编号为XG108和XG111的香菇克隆序列构建的检测载体命名为pXG108p、XG111。将pXG108转化到香菇原生质体中,结果被测样的GUS瞬时活性比对照增加一倍,表明GUS基因得到了表达,其上游调控元件具有调控功能。对比pXG108和pXG111转化后的表达结果,其GUS瞬时表达活性表现出差异,这种差异与克隆片段在酵母中的表达差异相一致。分析了利用GUS瞬时表达验证未知香菇顺式元件的优缺点。

几条随机克隆的香菇顺式因子特性分析

分析了6个利用启动子探测载体和酵母表达体系克隆得到的香菇顺式调控因子的调控稳定性和序列结构特征。在酵母中进行2次转化,根据在X-gal培养基上的显色初步研究其调控稳定性;根据显色深浅不同,判断其调控能力的强弱,并结合序列特征结构进行分析。结果显示,克隆片段在酵母中具有稳定的调控功能,所克隆序列具有丝状真菌生物启动子典型结构,如CT丰富区T、ATA框、GC框、CAAT框。详细分析了其中1条克隆片段序列特征,并与已知的香菇GPD启动子序列进行对比分析。初步探讨了香菇顺式调控元件的结构特点。

抗腹泻性贝毒软海绵酸多克隆抗体的制备与检测

制备了腹泻性贝毒软海绵酸(okadaic acid,0A)的多克隆抗体,鉴定了抗体特性。利用半抗原BSA偶联小分子毒素OA,制备完全抗原OA-BSA,免疫两只新西兰白兔,分离、纯化抗血清。用间接ELISA方法测定抗体效价,两个兔抗血清效价均达到128,000以上。IC50为2.852ng/mL。DOT BLOT测定抗体特异性,结果表明,抗体与抗原有特异性反应。试验表明,抗OA多克隆抗体制备成功,其质量较好,可用于将来的免疫检测研究。

抗微囊藻毒素胶体金检测试纸条研究

用自制的微囊藻毒素（Microcystin-LR,MC-LR）单克隆抗体与钥孔血蓝蛋白（KLH）偶联物为胶体金标记底物研究MC-LR胶体金免疫检测技术。制备各种粒径的胶体金,最终确定粒径30nm的胶体金作为标记抗MC-LR单克隆抗体效果最佳;制备半抗原MC-LR与KLH的偶联物;在硝酸纤维素膜上包被MC-LR与KLH的偶联物作为检测带、包被羊抗鼠IgG作为质控带,建立快速检测MC-LR的免疫层析试纸条方法,该方法在3-5min即可目测判断结果,灵敏度为2ng·mL-1;依据工艺流程,发明制备了微囊藻毒素MC-LR的免疫层析快速检测卡,该卡检测样本中的微囊藻毒素MC-LR含量阈值为2ng·mL-1。

食用菌分子转化研究状况

遗传育种是提高食用菌产量和质量的有效途径之一。传统的遗传育种方法周期长、见效慢，现代分子转化技术则提供了一种更为高效快捷的育种方式。最早报道的食用菌转化是1991年Challen等利用PEG法把外源DNA导人双孢蘑菇的原生质体中，获得转化子；随后又相继报道了几例食用菌如双孢蘑菇、平菇、草菇、杨树菇和香菇的转化试验。但至今尚未建立起有效的食用菌转化系统。目前在食用菌的转化研究中存在的问题主要有：（1）假阳性菌落的干扰；（2）外源DNA整合率不高；（3）外源基因整合后表达率不高；（4）转化子不稳定。其中影响转化的主要因素是低整合率和低表达率。遗传育种是提高食用菌产量和质量的有效途径之一。传统的遗传育种方法周期长、见效慢，现代分子转化技术则提供了一种更为高效快捷的育种方式。最早报道的食用菌转化是1991年Challen等利用PEG法把外源DNA导人双孢蘑菇的原生质体中，获得转化子；随后又相继报道了几例食用菌如双孢蘑菇、平菇、草菇、杨树菇和香菇的转化试验。但至今尚未建立起有效的食用菌转化系统。目前在食用菌的转化研究中存在的问题主要有：（1）假阳性菌落的干扰；（2）外源DNA整合率不高；（3）外源基因整合后表达率不高；（4）转化子不稳定。其中影响转化的主要因素是低整合率和低表达率。遗传工作者围绕如何提高整合率和表达率，不断改进转化方法、转化材料、标记基因、启动子，以期提高转化率，建立一个完善的转化体系。现就筛选标记、启动子、转化方法、整合方式及将来研究方向等方面，用具体的研究实验分析食用菌转化工作现状、取得的成绩和存在的问题。

腹泻性贝毒素软海绵酸的昆明系小鼠生物学检测法的建立

为完善腹泻性贝毒素软海绵酸(Okadaic acid,OA)的小鼠生物学检测技术,以昆明系小鼠为实验材料,应用小鼠生物学检测法检测了OA的毒性.用不同浓度OA标准溶液通过腹腔注入19～21g昆明系小鼠体内,观察其中毒症状,确定1个鼠单位(MU)所代表的毒素剂量,并且建立剂量-死亡时间曲线.结果表明,昆明系小鼠经OA腹腔注射后中毒症状和死亡时间具有明显剂量效应关系,其剂量-死亡时间曲线方程为y=600.57x-2.257,其中y代表致死时间(h),x代表剂量(μg);将死亡时间t变为时间倒数1/t,对OA的毒性MU取对数(即logMU),得直线回归方程为y=0.5363x+0.1295,R2=0.9488,p<0.01,其中y代表OA毒素剂量单位的对数(1ogMU),x代表小鼠死亡时间倒数(1/t),R2为可决系数.通过该方程计算得出,1个鼠单位(MU)所对应的OA剂量值约为4.015μg,其95%置信限为3.826～4.204μg.

基因芯片在海洋微藻研究中的应用前景

基因芯片通常指DNA芯片,其基本原理是将大量的寡核苷酸分子固定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号从而获取结果。多年来,我国在医药疾病研究、微生物检测等领域已成功研制出多种基因芯片,取得了骄人的成绩,但在对海洋微藻研究的应用上成果较少。现着力从实际应用的角度阐述基因芯片及其在海洋微藻研究中的应用。

软海绵酸胶体金免疫检测法的建立与应用

目的建立并应用软海绵酸(OA)胶体金免疫层析检测法。方法通过纯化抗OA单抗、制备胶体金、标记单抗、制备胶体金试剂条、样品模拟提取与加标回收检测、贝类染毒提取及检测,建立和优化金标免疫层析法。结果选择30nm胶体金颗粒用于单抗标记,金标单抗浓度为200μg/mL,金标单抗包被量为2.5μL/cm,二抗包被浓度为1.0mg/mL,反应时间为3～5min,对加标贝肉和染毒贝类的检测灵敏度为25ng/mL。结论建立了可用于OA检测的胶体金免疫层析检测法,满足规定的贝类OA含量安全阈值,为腹泻性贝毒检测与食品安全检验提供了新的技术方法。

微小亚历山大藻麻痹性贝类毒素小鼠生物检测

应用小鼠生物检测法对培养的微小亚历山大藻(LJX02株系)麻痹性贝类毒素进行了检测。首先建立微小亚历山大藻培养技术,利用对数期藻细胞接种,可使藻细胞处于快速生长,并在7d内藻细胞密度最高达到30000ml-1。从培养株系中提取的藻毒素,经液相质谱分析主要为GTX1/4和GTX2/3,其含量分别为12.23μg/ml和9.742μg/ml,12L藻体培养液中可获得18.35μgGTX1/4和14.61μgGTX2/3毒素量。采用小鼠生物检测法建立了藻毒素剂量-小鼠死亡时间曲线,其曲线方程为Y=74.017X-1.5896,将死亡时间t变为时间倒数1/t,GTX毒性MU取对数为logMU,得直线回归方程为Y=3.7009X-0.0858(R2=0.9824),求得了昆明小鼠一个鼠单位所代表的GTX1/4和GTX2/3毒素剂量分别为0.026μg和0.021μg。