大鼠βB2-晶体蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备

目的表达并纯化βB2-晶体蛋白,制备其多克隆抗体,用以研究βB2-晶体蛋白聚合的机制。方法用RT-PCR的方法扩增了βB2-晶体蛋白的cDNA并克隆到原核表达载体pMON5473中。用萘啶酮酸诱导recA启动子后,蛋白质在大肠杆菌中得到了高效表达。表达的蛋白质用DEAE纤维素层析和凝胶过滤纯化,SDS-PAGE显示一条带。与佐剂混合后免疫新西兰大白兔。结果纯化了大鼠βB2-晶体蛋白,成功制备了其多克隆抗体。结论制备的多克隆抗体为下阶段的研究提供了重要的实验材料。

中药巴戟天对晶状体醛糖还原酶的抑制作用

目的研究中药巴戟天对晶状体醛糖还原酶(AR)的抑制作用,以期找到一种治疗糖性白内障的中药。方法提取了中药巴戟天水溶性成分,以比色法检测其对大鼠和猪的晶状体醛糖还原酶的抑制作用。结果①本实验制备的酶液的比活性分别为:猪晶状体0.166μmol.min-1.mg-1protein,大鼠晶状体0.82μmol.min-1.mg-1protein;②巴戟天对猪晶状体醛糖还原酶的半数抑制浓度(IC50)为25 mg.L-1,对大鼠晶状体醛糖还原酶的IC50为46 mg.L-1。结论中药巴戟天水溶性成分对大鼠和猪晶状体醛糖还原酶有抑制作用。

续断等50种中药对猪晶体醛糖还原酶的抑制作用

分别将续断(Dipsacus japonicus Mip)等50种中药水提取液加入猪晶体醛糖还原酶(AR)反应体系中,测定AR的活性,发现续断、紫菀(Aster tataricus L.f.)对AR有较强抑制作用。IC_(50)分别为57μg/ml、102μg/ml。提示可能对糖性白内障有防治作用。

小鼠白细胞介素-18抗肝癌作用的初步研究

目的研究小鼠白细胞介素-18(mIL-18)对H22肝癌的作用。方法以1×105和1×106H22肝癌细胞腹腔注射昆明小鼠构建小鼠H22肝癌腹水瘤模型。在接种H22细胞后的1、48、天,每天用10μg mIL-18腹腔注射荷瘤小鼠,连续注射5天;或者在接种后1天,分别用5μg、10μg和20μg不同剂量的mIL-18腹腔注射小鼠。mIL-18作用后存活的小鼠,再次腹腔注射1×105H22肝癌细胞。结果构建得到小鼠H22肝癌腹水瘤模型,在接种1×105H22肝癌细胞后1、4天注射mIL-18的小鼠比对照组小鼠的存活率显著升高(P<0.05),存活小鼠能抵抗再次接种的H22肝癌细胞的攻击。结论mIL-18对小鼠H22肝癌具有显著抑制作用,mIL-18作用后存活的小鼠具有对H22肝癌细胞的免疫记忆性。

PDZ1-腺病毒重组体的构建及其对KA诱导的海马神经元凋亡的拮抗作用

目的构建PSD-95结构域PDZ1与腺病毒重组体并观察其对海人藻酸(KA)诱导的海马神经元凋亡的作用。方法采用RT-PCR法获得PDZ1的cDNA;与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV用T4 DNA连接酶连接;连接产物与骨架载体pAdEasy-1共转染至原核包装细胞BJ5183;将原核重组体用脂质体转入真核包装细胞293H;纯化包装后的病毒颗粒并测定其滴度;腺病毒感染培养的海马神经元,加入KA,用DAPI染色后荧光显微镜观察细胞凋亡;用流式细胞仪定量分析细胞凋亡率。结果①经RT-PCR得到了PDZ1的cDNA;②电泳鉴定得到原核重组体;③得到包装完整的具感染能力的病毒颗粒;④纯化的病毒颗粒滴度为1.08×109ifu/mL⑤病毒表达的PDZ1使KA诱导的海马神经元凋亡数量减少(P<0.05)。结论获得了能表达PDZ1-GFP的病毒颗粒,并且PDZ1过表达能拮抗KA诱导的海马神经元凋亡。

PSD-95结构域PDZ1与腺病毒穿梭载体重组体的构建

目的构建突触后致密物质-95(PSD-95)结构域PDZ1腺病毒重组体。方法以异硫酸氢胍-酚-氯仿一步法提取的总RNA为模板,采用反转录PCR(RT-PCR)法获得PDZ1的cDNA;与腺病毒穿梭载体用T4DNA连接酶连接;连接产物转化大肠杆菌JM109进行筛选、序列测定。结果①提取到未降解的总RNA;②经RT-PCR得到了PDZ1的cDNA;③酶切鉴定能观察到PDZ1和pAdTrack-CMV两条带;④PDZ1测序图谱与文献报道完全一致。结论获得了含目的基因PDZ1的腺病毒穿梭载体重组体。

Ad-PDZ1-GFP的原核重组与真核包装

目的对Ad-PDZ1-GFP穿梭重组体与骨架载体进行原核重组和真核包装。方法将Ad-PDZ1-GFP穿梭重组体与骨架载体以电穿孔法共转染至原核包装细胞BJ5183;再将原核重组体用脂质体转入真核包装细胞293H进行包装。结果①电泳鉴定得到原核重组体;②得到完整的具感染能力的病毒颗粒;③病毒颗粒能表达标签蛋白。结论获得了具有感染能力的病毒颗粒。

TAT—GluR6—9C与pMON原核表达载体重组体的构建

目的表达和纯化TAT—GluR6—9C小肽，用于脑缺血细胞信号转导的研究。方法用化学合成的方法获得TAT—GluR6—9C小肽的cDNA；与原核表达载体pMON用T4DNA连接酶连接；连接产物转化大肠杆菌JMl09进行筛选、序列测定。结果①经化学合成并退火得到了TAT—GluR6—9C的双链cDNA；②酶切鉴定能观察到TAT—GluR6—9C和pMON两条带；③TAT—GluR6—9C测序图谱与GenBank报道完全一致。结论获得了含目的基因TAT—GluR6—9C的pMON原核表达载体重组体。

黄色素抑制血管平滑肌细胞增殖与3种蛋白激酶的关系

目的 :研究黄色素 (SY)对血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖的作用及机制。方法 :以培养的家兔VSMC为材料 ,用细胞计数和32 P 参入法 ,观察SY对VSMC的增殖及 3种蛋白激酶活性。结果 :SY抑制VSMC的增殖 ,且呈剂量和时间依赖性 ,1 0mg·mL-1作用最强 ,抑制率为 5 4 6% ;SY抑制VSMC的DNA合成 ,1 0mg·mL-1作用 2d ,抑制率为 80 2 % ;在一定浓度范围内 ,随着SY浓度的升高 ,VSMC中 3种蛋白激酶 (TPK ,PKC及MAPK)活性下降。结论 :SY对VSMC的增殖有抑制作用 。

红花素对晶体醛糖还原酶的抑制作用

醛糖还原酶(aldose reductase,AR;alditol:NADP oxidoreductase,EC 1.1.1.21)以NADPH为辅酶催化醛糖的还原反应。已有证据表明,它在糖性白内障的形成过程中起着关键性的作用。因此寻找有效,低毒的醛糖还原酶抑制剂(aldose reductaseinhibitor,ARI)

人白细胞介素18的原核表达及多克隆抗体的制备

目的 在原核系统中表达并纯化人白细胞介素 18(hIL 18) ,制备兔抗人白细胞介素 18多克隆抗体。方法 用RT PCR扩增出hIL 18的cDNA ,克隆到原核表达载体pJW2中 ,转化大肠杆菌JM10 1中诱导表达并纯化。用纯化的人白细胞介素 18免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果 克隆得到序列正确的hIL 18cDNA ,与载体连接后转化入大肠杆菌JM10 1中诱导表达并成功纯化 ,并用纯化的人白细胞介素 18成功制备了兔抗人白细胞介素 18多克隆抗体。

Ki67反义多肽核酸抑制肾癌生长的体外及动物实验研究

为研究肿瘤增殖基因Ki67反义多肽核酸(AS-PNAs)对人肾癌细胞的体内外抑制作用.将AS-PNAs(10.0μmol/L)转染人肾癌786-0细胞,采用免疫组化、Western印迹技术检测Ki67表达;3H-TdR掺入试验检测细胞增殖;免疫组化TUNEL法检测细胞凋亡。裸鼠移植瘤内注射AS-PNAs(10.0μmol/L)连续4d后,第3、6、12天处死小鼠,取瘤组织检测肿瘤体积、Ki67表达、细胞凋亡。结果发现,AS-PNAs处理组786-0细胞Ki67表达明显降低,3H-TdR掺入率明显降低,细胞凋亡率明显增加,与随机PNAs对照组比较差异均有显著性(P<0.01)。动物实验AS-PNAs处理组小鼠肿瘤体积明显缩小,Ki-67抗原表达明显降低,细胞凋亡明显增加,与对照组比较差异均有显著性(P<0.01)。Ki67基囚AS-PNAs在体外及动物体内均有抑制增殖、促进凋亡作用,是一种有前途的反义治疗药物。

老化过程中人晶状体蛋白质的改变

用凝胶过滤和SDS-PAGE对不同年龄人透明晶状体水溶性蛋白、尿素溶蛋白及纤维细胞膜内在蛋白进行了分析。随着年龄的增长,HM+α-晶体蛋白的相对含量增加,而β-、γ-晶体蛋白降低。四岁儿童晶状体含有较多的β_1-晶体蛋白,成人晶状体则含量明显降低。成人晶状体尿素溶蛋白的主要成分为α-晶体蛋白,而四岁儿童晶状体尿素溶蛋白中α-晶体蛋白及23kDa的β-晶体蛋白成分含量均较高并含有较多的细胞骨架蛋白。细胞膜主要内在蛋白(MIP)的相对含量随年龄的增长而下降,而MP23升高。

大鼠糖性白内障发展过程中钾钠镁锌含量的动态变化

用Jarrell-Ash 1100 ACP光谱仪,检测了大鼠糖性白内障发展过程中钾、钠、镁、锌含量的动态变化。实验表明,正常对照组大鼠晶体中钠钾比值是0.28～0.30;而在白内障成熟期,晶体中的钠/钾比值上升至3.01。镁、锌在大鼠糖性白内障晶体中的含量低于正常对照组。

大鼠FasL基因重组慢病毒载体三质粒包装细胞系统的建立

目的建立真核细胞表达的大鼠FasL基因重组慢病毒载体三质粒包装细胞系统,为进一步研究转FasL基因在同种异体器官移植中诱导免疫耐受、保护移植物的作用奠定基础。方法制备完整的重组慢病毒载体三质粒系统:转移质粒(pLO134-FasL),包装质粒(ΔNRF)及包膜蛋白质粒(VSV-G)。脂质体法将三质粒共转染包装细胞293T,72 h后收集病毒上清,Western-blot法检测293T细胞的FasL蛋白表达。结果转染后的293T细胞表达FasL蛋白。结论成功建立重组慢病毒载体的三质粒包装细胞系统。

脑脊液诱导的骨髓源性神经样细胞移植的安全性研究

目的研究脑脊液诱导的骨髓源性神经样细胞（BMSC—Ns）移植的安全性。方法将40只4。6周龄裸鼠采用随机数字表法分为5组（n=8），其中致瘤性实验3组：阳性对照组（A组），接种Hela细胞（2×107／0．2m1）；实验组（B组），将BMSC—Ns按2×107／0．2ml接种至裸鼠肋部皮下；阴性对照组（C组），注射等体积生理盐水。接种后饲养1个月，大体观察肿瘤形成情况，1个月后处死动物取注射处局部皮肤、心脏、肝脏、肠道和肺组织，行H—E染色观察病理学改变。全身毒性实验2组：实验组（D组），裸鼠尾静脉注射大鼠BMSC—Ns（5x106／0．2m1）；阴性对照组（E组），注射等体积生理盐水。注射后即刻观察动物临床反应，以后每天观察1次，连续观察15天；将动物处死，采集血液标本行血液学检查。结果BMSC—Ns接种于裸鼠肋部皮下1个月后未见接种部位肿瘤形成，局部皮肤、心脏、肝脏、肠道和肺组织病理学检查未见异常；尾静脉注射BMSC—Ns后动物一般情况无异常，至第15天裸鼠全部成活，血常规结果无异常。结论皮下接种或者尾静脉移植CSF诱导的BMSC—Ns对裸鼠是安全的，无致瘤性和全身毒性。

人IL-18突变体D134R的构建及其生物学活性分析

目的研究IL-18结构与功能的关系。方法用重叠延伸PCR定点突变技术构建人白介素18(hIL-18)突变体hIL-18D134R。将突变体cDNA与原核表达载体pJW2重组并转化大肠杆菌DH5α。经热诱导表达蛋白质,SDS-PAGE证实,表达的目的蛋白质以包涵体形式存在。菌体经超声破碎后,包涵体以2 mol/L尿素洗涤,8 mol/L尿素溶解,并经Sephadex G-75柱纯化及稀释、透析复性。然后以诱导人外周血单个核细胞(PBMC)产生干扰素-γ(IFN-γ)及对核因子-κB(NF-κB)的激活能力为指标,检测突变体的生物学活性。结果构建的突变体hIL-18D134R可在大肠杆菌DH5α中高效表达,经包涵体洗涤和Sephadex G-75柱纯化后,纯度达92%以上。突变体D134R对IFN-γ的诱生能力及对NF-κB的激活能力分别为野生型hIL-18的19%和23%。结论在人IL-18的氨基酸序列中,Asp134对其生物学功能有非常重要的作用。

PDZ1/2结构域与腺病毒穿梭载体重组体的构建

目的构建PSD-95结构域PDZ1/2腺病毒重组体。方法以异硫酸氰胍-酚-氯仿一步法提取的总RNA为模板,采用RT-PCR法获得PDZ1/2的cDNA;与腺病毒穿梭载体用T4 DNA连接酶连接;连接产物转化大肠杆菌JM109进行筛选、序列测定。结果①经RT-PCR得到了PDZ1/2的cDNA;②酶切鉴定能观察到PDZ1/2和pAdTrack-CMV两条带;③PDZ1/2测序图谱与文献报道完全一致。结论成功构建了含目的基因PDZ1/2的腺病毒穿梭载体重组体。

免疫球蛋白G促进胶质瘤细胞系U87MG中PCNAP-ERK及P-SRC的表达

目的了解在体外培养条件下人源性免疫球蛋白G(IgG)刺激人胶质瘤细胞系U87MG后,对增殖细胞核抗原(PCNA)、激活的细胞外信号调节激酶(P-ERK)及激活的非受体酪氨酸激酶(P-SRC)表达的影响。方法用不同浓度的IgG(0.01、0.1、1μg/mL)刺激U87MG,24h后采用Western blot方法检测PCNA、ERK及P-ERK、SRC及P-SRC的表达变化情况。结果 IgG直接作用于体外培养的胶质瘤U87MG后,相对于对照组而言PCNA、P-ERK及P-SRC表达有明显的升高,并且表达呈现出一定的剂量依赖性。结论 IgG可能与神经系统癌症有关联。

抗人膀胱癌单克隆抗体轻链可变区基因的克隆及其原核表达载体的构建

目的 克隆抗人膀胱癌单克隆抗体轻链可变区基因 (VL) ,并构建其原核表达载体。方法 从能分泌抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞BDI- 1中提取总RNA ,通过RT -PCR扩增出VLcDNA。用HindⅢ和XhoⅠ酶切纯化的RT -PCR产物和原核表达载体pET2 8a(+) ,在T4 DNA连接酶作用下室温连接 ,重组质粒经酶切鉴定 ,阳性克隆测序并进行序列分析。结果 扩增出VLcDNA片段 ,大小约为 340bp ,重组质粒的酶切鉴定结果与预期一致。VL 基因序列长度为 32 4bp ,编码 10 8个氨基酸。VL 基因属于鼠免疫球蛋白κ轻链Ⅳ亚类。结论 成功克隆出抗人膀胱癌单克隆抗体轻链可变区基因 ,并成功构建其原核表达载体。