利用CRISPR/Cas9技术创制高油酸甘蓝型油菜新种质

在低硫苷低芥酸的双低甘蓝型油菜基础上,培育稳定的高油酸油菜是当前重要的育种目标之一,本研究通过利用CRISPR/Cas9基因编辑对湖南农业大学选育的品种湘油15号(XY15)进行品种改良。BnaFAD2和BnaFAE1是油酸合成不饱和脂肪酸和超长链脂肪酸的两个关键基因。利用CRISPR/Cas9基因编辑系统与高效油菜转化技术相结合,对甘蓝型油菜XY15的BnaFAD2.A05、BnaFAD2.C05、BnaFAE1.A08和BnaFAE1.C03同时进行基因编辑,获得了7株T0代转基因植株,通过靶基因克隆测序,发现均未发生基因编辑。然而,在T1代植株中发现并检测到了基因编辑的发生,BnaFAD2.A05、BnaFAD2.C05、BnaFAE1.A08和BnaFAE1.C03的总基因编辑效率分别为38.89%、27.78%、22.22%、30.56%。在T2代植株中,筛选到了5株4个靶基因均发生了突变,且无外源基因的突变体材料Cas9-1-12-4、Cas9-1-12-5、Cas9-2-7-11、Cas9-5-5-3、Cas9-6-6-1,它们的相对油酸含量为68.69%、80.16%、75.82%、75.97%、74.37%,相比于野生型XY15(相对油酸含量为62.04%)均有显著提高。

甘蓝型油菜BnaGTR基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建及基因编辑分析

硫苷是植物中抵抗生物胁迫危害的重要防御物质。硫苷转运蛋白属于硝酸盐转运蛋白/肽转运蛋白家族(NRT/NPF),是一类能转运以硫代葡萄糖苷为底物的跨膜运输蛋白。为探究甘蓝型油菜中占硫苷总量90%以上的脂肪族硫苷的转运,本研究以拟南芥中脂肪族硫苷转运蛋白AtGTR1和AtGTR2基因序列做参考,通过同源性比对筛选出4个甘蓝型油菜同源基因BnaGTR1.A、BnaGTR1.C、BnaGTR2.A和BnaGTR2.C。分别针对BnaGTR1和BnaGTR2基因预测跨膜功能区,选取相同的保守序列作为CRISPR/Cas9基因编辑系统的靶位点,成功构建pCAMBIA1300-BnaGTRs敲除载体。利用农杆菌介导的甘蓝型油菜下胚轴转化法,成功将敲除载体的表达框转入高硫苷的甘蓝型油菜品系GZ522;共获得转基因植株10株,其中成功发生编辑的3株,编辑效率为33.33%。这些结果为进一步探究甘蓝型油菜中脂肪族硫苷转运和相应的转运蛋白的功能提供了依据。

甘蓝型油菜BnaABI4基因CRISPR/Cas9编辑载体的构建及甘蓝型油菜转化

ABI4(Abscisicacid-insensitive4)是ABA响应途径中重要的转录因子。本研究以甘蓝型油菜全基因组数据库为基础,借助拟南芥ABI4蛋白的氨基酸序列,通过序列比对,获得了甘蓝型油菜的2个BnaABI4,分别命名为BnaABI4-A (GenBank登录号为BnaA03g18970D)和BnaABI4-C (GenBank登录号为BnaC03g725-10D)。在这两个基因的CDS序列上寻找一段长度为20 bp、序列相同的片段作为基因编辑的目标位点,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体pCAMBIA1300-sg RNA/Cas9-BnaABI4;借助根癌农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化法,成功将BnaABI4的基因编辑表达框转入甘蓝型油菜‘湘油15’中,共获得转基因植株13株,这将为深入研究甘蓝型油菜BnaABI4的生物学功能提供科学依据。