菠萝凋萎相关病毒-3实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立菠萝凋萎相关病毒-3实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据PMWa V-3外壳蛋白基因的保守区域设计特异性引物和探针,通过优化PMWa V-3实时荧光定量PCR检测体系,构建以重组质粒为标准品的标准曲线,建立起PMWa V-3实时荧光定量PCR检测方法。【结果】该方法能特异性地检测PMWa V-3,且灵敏度是普通RTPCR的10倍;该方法重复性良好,组间和组内变异系数均小于1.73。【结论】建立的实时荧光定量PCR方法是一种快速、简便、可信度高的PMWa V-3定量检测方法。

菠萝凋萎相关病毒-1实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立与应用

菠萝凋萎相关病毒-1(Pineapple mealybug wilt associated virus-1,PMWaV-1)是田间检出率最高的菠萝凋萎病毒。本研究根据PMWaV-1CP基因保守序列设计特异性TaqMan探针和引物,建立并优化了PMWaV-1实时荧光定量RT-PCR检测方法。优化后的反应体系制备的标准曲线为y=-3.307×log x+38.18,相关系数r2为0.998。试验结果表明,该方法能特异性地检测PMWaV-1,对PMWaV-2、3和阴性对照均无反应;最低检测限达到40拷贝。重复性试验表明批内和批间变异系数均小于1.98%,是一种操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性较好的PMWaV-1定量检测方法。样品检测结果表明PMWaV-1在菠萝植株老叶、嫩叶和吸芽中的病毒含量呈递减趋势。

同步检测PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3的三重RT-qPCR方法的初步建立

目前我国菠萝产区已相继报道3种菠萝凋萎相关病毒(PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3)。通过建立这3种菠萝凋萎相关病毒实时荧光定量RT-PCR(RT-q PCR)同步定量检测方法,为菠萝凋萎病毒的定性定量研究提供技术手段。根据这3种菠萝凋萎相关病毒的外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物和Taq Man水解探针,在优化PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-q PCR反应体系后,以PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3 CP基因目的片段的重组质粒为标准品绘制标准曲线,初步建立了PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-q PCR检测方法。其中PMWaV-1标准曲线为y=-3.283logx+39.02,其扩增效率达101.7%,线性相关系数R2=0.999;PMWaV-2标准曲线为y=-3.393logx+37.53,其扩增效率为97.1%,线性相关系数R2=0.998;PMWaV-3标准曲线为y=-3.171 logx+38.48,其扩增效率为106.7%,线性相关系数R2=0.996;这表明3种菠萝凋萎相关病毒质粒标准品在同一反应体系中可稳定扩增,且线性关系表现良好,可用于后续试验。灵敏度试验数据表明,该方法对PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的最低检测线分别为99,98,868拷贝;重复性试验表明PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-q PCR扩增曲线的标准差小于0.267,变异系数小于1.44%。这表明建立的三重RT-q PCR检测方法可快速、准确、稳定地定量检测PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3等3种病毒,为PMWaV的定性定量研究和复合侵染机制的探索提供了技术基础。

海南黑金刚莲雾四季生产技术

黑金刚莲雾是一个优良、具有较强商业和观赏价值的台湾莲雾新品种。本文针对黑金刚莲雾的生长特性,着重介绍该品种在海南生产过程中的水肥管理、树体管理、花果管理等关键技术,为提高黑金刚莲雾周年生产提供一定的技术依据。

一种菠萝果腐病病原初步鉴定及生物学特性研究

从海南菠萝产区的一种菠萝果腐病疑似样本中分离到了7株形态相近的真菌菌株,形态学鉴定结果表明该菌为链格孢菌[Alternaria alternata(Fr.)Kiessler];生物学特性研究结果表明,菠萝果皮榨汁培养基和PDA为病原菌生长适宜培养基;菌丝生长和孢子萌发最适生长温度均为28℃;菌丝生长和孢子萌发最适pH值分别为9和8;麦芽糖、果糖和半乳糖有利于菌丝生长,而果糖、半乳糖和蔗糖为病原分生孢子萌发的最适宜碳源;病原菌生长的适宜氮源为硝酸铵、酵母浸粉和天冬氨酸,酵母浸粉和天冬氨酸则有利于孢子萌发;完全光照最利于菌丝生长,分生孢子在光/暗交替条件下萌发率最高;病原孢子在RH≥95%的条件下才能萌发,水滴条件下孢子萌发率最高;病原菌致死温度为55℃处理20 min。

香蕉分化芽BBTVDAS-ELISA检测方法的建立和应用

为了解海南海口香蕉分化芽携带香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)的情况,本研究建立了双抗夹心酶联免疫反应(DAS-ELISA)检测法,对来自海南地区组培厂的香蕉分化芽进行检测。检测结果表明,6个品种1 852个香蕉分化芽平均带毒率为2.1%,其中‘皇帝蕉’为1.98%,‘粤科1号’为2.07%,‘广粉蕉’为1.98%,‘大蕉’为6.25%,‘218’为1.89%,‘巴西蕉’为2.25%。为了进一步验证ELISA结果的可靠性,随机选取12个阳性样品提取总DNA进行PCR鉴定。鉴定结果显示,12个样品中11个检测出有BBTV,表明DAS-ELISA方法的准确率较高,与分子检测结果基本一致,可以胜任日常香蕉组培苗BBTV的检测。

应用实时荧光定量PCR研究BBTV DNA1在香蕉不同组织中的含量

为准确定量香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)DNA1组分在香蕉组织中的分布和含量,建立以SYBR Green-I荧光染料为标记的实时荧光定量PCR(Real Time Fluorescence Quantitative PCR)方法。利用B1-F/B1-R引物扩增海南BBTV DNA1组分并构建到pMD18T sample载体,再以B2-F/B2-R引物测定该质粒的标准曲线,其线性方程为Y=-3.247×LOG(X)+8.01,相关系数r2=0.997,扩增效率为103.2%,标准质粒检测灵敏度约为214 copies/μL。分别选取染病香蕉的嫩叶、叶鞘、假茎和球茎各100 mg,提取DNA并进行实时荧光定量PCR检测。结果表明:病株各部位均含BBTV病毒,但含量有明显差异,其中嫩叶(3.08×108 copies/mg)>叶鞘(2.50×108 copies/mg)>假茎(1.29×108 copies/mg)>球茎(1.67×107 copies/mg),呈依次递减。

海南省2种山竹真菌病害的分离与鉴定

山竹作为重要的特色热带水果,近年在海南种植面积不断扩大。但山竹病害频繁发生,严重制约着其产业的健康发展。作者于2018年5月至2019年9月对海南省保亭县山竹病害进行了调查,发现叶斑病和枝条溃疡病对山竹危害较为严重。为了明确病害的病源,本研究通过形态学观察、ITS序列分析结果以及科赫法则验证致病性测定,将病原菌分别鉴定为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora)。该研究结果可为山竹病害诊断和防治提供科学依据。

菠萝凋萎相关病毒–2实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

菠萝凋萎相关病毒(Pineapple mealybug wilt associated virus-2,PMWaV-2)是引起的菠萝凋萎病(Mealybug wilt of pineapple,MWP)的重要病原。本研究中根据PMWaV-2外壳蛋白基因序列设计特异性引物和探针,建立基于TaqMan探针的实时荧光定量RT-PCR检测方法。该方法能高灵敏检测出阳性样品,对阴性样品及空白对照均无荧光反应;灵敏度比普通PCR高100倍;重复性试验表明批内和批间变异系数均在1.85%以内,表明本方法是一种操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性较好的PMWaV-2定量检测方法。

菠萝MADS-box基因家族的生物信息学分析

MADS-box转录因子是植物生长发育过程的重要调控因子。为了解菠萝MADS-box转录因子的序列特征和分类情况,本研究采用生物信息学方法,对菠萝全基因组的MADS-box进行序列分析,包括菠萝MADS-box转录因子的数量、外显子和内含子组成情况、编码蛋白的基本特性及系统进化树的分析。结果表明,菠萝基因组中有40个MADS-box转录因子,且基因结构分析表明8个菠萝MADS-box基因符合植物MADS-box基因的典型结构,具有6个内含子和7个外显子;27个菠萝MADS-box转录因子编码氨基酸在200~300个之间,其中最小的Ac MADS40仅有104个氨基酸组成,最大的Ac MADS08由436个氨基酸组成;40个MADS-box蛋白中有31个偏碱性,4个显酸性,5个呈中性;二级结构分析结果表明,6个MADS-box蛋白无规卷曲所占比例最高,Ac MADS02α-螺旋和无规卷曲都为25个,β-转角为5个;其余33个菠萝MADS-box蛋白均以α-螺旋所占比例最高;亚细胞定位预测结果表明,大多数MADS-box蛋白定位于细胞核,其他零星分布于其他细胞器;保守基序查找分析表明,包含基序1和基序2的MADS-box蛋白所占比率均在85%以上,说明基序1和基序2是菠萝MADS-box蛋白中的重要保守基序;系统进化树分析表明,属于Ⅰ型的菠萝MADS-box基因有14个,属于Ⅱ型的菠萝MADS-box基因有26个,且可细分为11个亚组,除了FLC和AGL15这两个亚组中没有菠萝MADS-box的成员,其他9个亚组均有菠萝MADS-box基因的分布。

进境玉米中玉米内州萎蔫病菌PCR检测方法评估

为了准确检测玉米样品中玉米内州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis,Cmn),减少测试过程中的假阳性和假阴性结果,利用15对Cmn特异性引物/探针分别测试了Cmn及其他菌株63株,并测试了食用、种用和饲用进境玉米样品300个。测试结果表明,常规PCR和实时荧光PCR方法阳性检出率最高的引物/探针分别是引物PSA-7/PSA-R和探针Cmn-MGB;巢式PCR不适用于样品中Cmn的检测;检测过程中引物Cmn-4F/Cmn-4R和探针rpsJ27P出现假阴性,引物CmnFP/CmnRP出现假阳性。根据测试结果,引物PSA-7/PSA-R和探针Cmn11-P可用于口岸进境玉米样品Cmn检测。

进境澳大利亚绿豆中菜豆细菌性萎蔫病菌的检测

利用NA培养基从澳大利亚进境绿豆样品中分离到一株疑似菜豆细菌性萎蔫病菌(Curtobacterium flaccumfaciens pv.flaccumfaciens,Cff)的细菌分离物2000-1,对该分离物进行革兰染色试验、PCR检测、多位点序列分析和致病性测试。分离物在NA平板上菌落浅黄色,圆形,隆起,黏性,有光泽且边缘整齐,革兰染色阳性。特异引物CffFOR2/CffREV4可扩增出306 bp的预期产物。分离物2000-1的16S rRNA序列与Cff菌株ATCC 51876完全一致,与GenBank中Cff菌株P990的序列相似性为99.58%,序列差异为3 nt。基于6个看家基因(atpD、dnaK、gyrB、ppK、recA和rpoB)的系统发育树显示,分离物2000-1与Cff相关种处于同一分支,与其中巴西大麦Cff分离物3185 UNESP亲缘关系最近,而与菌株ATCC 51876处于不同分支。分离物人工接种可引起大豆叶片水渍状病斑,大豆叶片出现萎蔫和焦枯,病斑周围伴有金黄色晕圈。根据以上测试结果,将分离物2000-1鉴定为菜豆细菌性萎蔫病菌(Curtobacterium flaccumfaciens pv.flaccumfaciens)。这是全国首次从进境绿豆中截获Cff。