产鲨烯重组大肠杆菌的构建及发酵研究

鲨烯是一种在食品、医药等行业有着广泛应用的三萜类化合物。大肠杆菌被认为是非常有潜力的合成鲨烯的底盘细胞。为提高大肠杆菌内鲨烯的合成水平,以三个诱导型启动子p3-lac、p6-lac、p10-lac强度为水平,以dxs、idi、ispA三个4-磷酸甲基赤藓糖醇途径(methylerythritol 4-phosphate pathway,MEP)的限速酶基因作为因素,进行正交设计,同时引入鲨烯合酶基因,构建了9株重组菌株进行鲨烯发酵实验。通过绿色荧光蛋白表达水平确定了p3-lac启动子强度相对最强,p10-lac相对最弱。通过分析正交发酵实验数据的极差,发现dxs是影响鲨烯产量最主要的因素,其次是ispA,最后是idi,且三个因素最佳水平组合所对应的菌株为1063/DE3,产量达到了450 mg/L。最终获得了一株鲨烯产量相较于出发菌株提高了681倍的产鲨烯重组大肠杆菌菌株,并为提高大肠杆菌内鲨烯产量提供了新的策略。

组合生物合成研究进展

组合生物合成是在抗生素产生菌的次级代谢产物合成途径中涉及到的一些酶的编码基因之间的互换 ,从而产生许多新的“非天然的天然化合物”。本文综述了近二年来组合生物合成的研究所取得的进展 ,着重介绍了 类 PKS的研究结果 ,并对 类 PKS、NRPS及

代谢工程研究及其在柔红霉素产生菌中的应用

综述了应用代谢工程技术对微生物次级代谢的调控,以及与组学研究相结合的研究进展,并结合我院对抗生素产生菌的代谢工程研究,总结了在柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌中所取得的一些阶段性研究结果。

顶头孢霉遗传育种研究进展

顶头孢霉是一类重要的工业微生物,其发酵产物头孢菌素C可用来生产7-ACA,而后者是临床常用抗感染药物头孢类抗生素的重要中间体。头孢菌素C的发酵水平决定了其下游头孢类抗生素的生产水平、产品质量及价格,因此对顶头孢霉的菌种选育工作显得尤其迫切。随着分子生物学的发展,基因工程分子改造在遗传育种领域发挥着越来越重要的作用。文章综述了对头孢菌素C的生物合成以及调控的研究进展,并将国内外对顶头孢霉进行遗传育种的结果进行了归纳总结,提出了可以从提高头孢菌素C发酵水平、延伸代谢途径等不同方面对头孢菌素C生物合成及调控基因,包括外源基因的导入和表达进行改造优化,并对进一步的研究目标进行了展望,认为可以结合比较蛋白质组和基因组改组使遗传育种所获得的工程菌尽快进入产业化。

利用酵母双杂交系统筛选β-内酰胺酶的结合肽

构建了含有来自于质粒pBR322的β-内酰胺酶基因的诱饵质粒,利用酵母双杂交系统从随机序列八肽库中进行筛选,通过初筛、复筛验证获得了1个阳性转化子。DNA序列测定结果表明其编码了1段八肽,体内显示具有结合β-内酰胺酶的能力。

双杂交系统:新兴的检测蛋白——蛋白交互作用的有力工具

蛋白——蛋白交互作用（ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）是生命活动持续的最基本的根据，细胞内的信号传导也是研究细胞的发育、分化及疾病的生理反应所要了解的最终目标。国际上出现了一种直接于细胞内检测蛋白——蛋白交互作用且灵敏度很高的遗传学新方法，酵母双杂交系统（ｙｅａｓｔｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍ），可迅速鉴别新的信息传递蛋白。本文综述了双杂交系统的原理、发展概况、应用范围及需注意的一些问题，并对它将来的发展及应用作了一些展望。

质粒pMEA 100A的AUD片段在大肠杆菌中的克隆

质粒ｐＭＥＡ１００Ａ是从地中海拟无枝酸菌中分离到的天然质粒，对该质粒的初步研究表明，该质粒上有一段２．０ｋｂ的ＤＮＡ可扩增单元（ＡＵＤ），在拟无枝酸菌中可自我扩增２～１０个拷贝。为了研究不同宿主对ＡＵＤ扩增的影响，尝试将含ＡＵＤ的不同的ＤＮＡ片段克隆到质粒ｐＵＣ１９并转化大肠杆菌ＪＭ８３。结果发现，将６．２５ｋｂ的含ＡＵＤ的ＳａｃⅠ－ＨｉｎｄⅢＤＮＡ片段导入大肠杆菌，ＡＵＤ能在大肠杆菌中自我扩增，拷贝数与在原宿主菌中相仿；其它一些较小片段的含ＡＵＤ的亚克隆子，均未发现自我扩增现象，表明６．２５ｋｂ的Ｓａｃｌ－ＨｉｎｄⅢ片段是维持自我扩增能力必需的最小ＤＮＡ片段。

利用酵母双杂交系统筛选IRR的结合蛋白

由于 型糖尿病病人对胰岛素不敏感 ,胰岛素受体相关受体 (IRR)的配体将对这些病人具有潜在的治疗作用。构建了以 IRR为筛选靶位的诱饵质粒 ,并利用酵母双杂交系统进行初步筛选 ,在筛选过程中考察氨基三唑(AT)浓度对转化子的影响。经过初筛复筛得到了 1个阳性转化子 ,测定这段 c DNA的序列并通过 Gen Bank搜寻 ,发现它编码的一段开放读框 (ORF)和δ-氨基乙酰丙酸脱水酶基因 (HEM2 )具有一定的同源性 。

随机序列八肽库的构建及其在双杂交系统中的应用

目的:构建一个随机序列八肽库并从中寻找非天然的具有药用价值的多肽。方法:利用基因工程技术构建随机序列八肽库,首先设计并合成了含8个密码子的随机寡核苷酸链,摸索了变性温度与时间、复性温度与时间、延伸温度与时间以及循环数后利用PCR扩增了这一片段,并解决了片段回收、连接等步骤,最后比较了不同的转化方法,采用最简便高效的TSS法转化大肠杆菌建立了随机序列八肽库。结果:利用作者所建立的随机序列八肽库应用于酵母双杂交系统并从中筛选到了一段感兴趣的多肽。结论:随机序列八肽库构建成功并且具有应用价值。

定量检测振动觉阈值的自动方法研究

介绍了自主研发的一套用于评价人体外周神经纤维功能的振动觉阈值定量检测系统.该系统的设计以神经生物学原理和实验心理学理论为基础.阈值由渐增渐减转换规则和强迫选择法两者联合得到,并用心理物理学统计算法过滤人体主观感受的影响.该系统具有医生病人双盲的自动检测功能,也兼具医生干预.用该振动觉阈值检测系统进行两组不同的对比实验,分析结果表明,该系统具有良好的重复性、可靠性和精确性.

PEG/LiAc转化酵母细胞方法的改进

PEG／LiAC法转化酵母适用于酵母双杂文系统的大量筛选，并能获得106转化子／μg质粒以上的转化率，但如果没有进口的PEG3350而采用分子量接近的国产PEG4000进行转化的话，转化率仅为104，远低于文献报道的水平。我们报道了一个改进的PEG／LiAc方法，采用国卉PEG6000，转化率也能达到106，且能将热激时间从20min缩短为2min。

右旋糖酐蔗糖酶工程菌株的构建及其培养条件的研究

【目的】右旋糖酐蔗糖酶是一种以蔗糖为底物,催化转移D-葡萄糖基生成α-葡聚糖或低聚糖的葡萄糖基转移酶。【方法】利用PCR扩增技术,将已获得的右旋糖酐蔗糖酶基因dexYG亚克隆到表达载体PET28a(+)上,转化E.coli BL21(DE3),经过卡那霉素抗性筛选和酶切验证后,得到右旋糖酐蔗糖酶工程菌株BL21(DE3)/pET28-dexYG。【结果】经IPTG诱导该基因在E.coli BL21(DE3)中能有效表达,在诱导过程中菌体生长受到抑制。通过对培养时间、IPTG浓度、培养温度、菌浓(OD600)和pH值等产酶因素的优化考察,得到最佳培养条件为:培养时间5h、IPTG浓度0.5mmol/L、25℃、OD600值1.0和pH6.0。酶活力由最初的5.39U/mL提高到35.62U/mL,其中pH值对产酶活力影响最大,在pH6.0时的最高产酶活力是LB原始pH条件下最高酶活的3.5倍,并且pH值也是导致在诱导后期酶活迅速下降的主要原因之一。【结论】酶的表达和酶活的研究结果表明,构建的工程菌株能够异源高效表达右旋糖酐蔗糖酶,并且表现出较高的酶活力。

重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶的纯化及其性质

【目的】研究工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28-dexYG产右旋糖酐蔗糖酶的纯化和酶学性质。【方法】工程菌经过IPTG诱导后生产含His-tag融合蛋白的右旋糖酐蔗糖酶,通过硫酸铵沉淀、Ni-NTA亲和层析纯化,得到纯度较高的酶蛋白,并对纯酶进行了酶学性质及动力学研究。【结果】经过SDS-PAGE测得该酶的分子量约为170kDa,与理论推测值基本相同。以蔗糖为底物,酶促反应的最适温度为25～30℃,最适pH值为5.4,动力学常数Km值为10.43mmol/L;酶活在pH5.0～8.0较为稳定,在室温(25℃)保藏4天仍有59%的酶活力,4℃保存7周酶活力仅下降一半,但在35℃以上失活很快;Ca2+对催化作用有较大的促进,Mg2+有微弱的促进作用,K+对催化反应无影响,Cu2+的抑制作用最强。其他试剂对重组酶的活性有不同程度的影响,其中SDS抑制作用很强。【结论】研究为重组右旋糖酐蔗糖酶纯酶的获取、得到稳定性好、活性高的酶反应体系及利用该酶进行催化反应和工业化应用提供了重要参数。

柔红霉素产生菌Streptomyces coeruleorubidus SIPI-1482中dnmV基因的克隆及阻断

从柔红霉素产生菌SIPI-1482菌株基因组DNA中PCR扩增得dnmV及其上游dnmU基因片段。利用同源重组对SIPI-1482菌株的dnmV基因进行基因阻断,得到一株遗传稳定的破坏子。验证了在该菌株中进行同源重组所需交换臂长度。

大蒜蒜氨酸酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

提取大蒜总RNA,经RT-PCR扩增出1348bp的成熟蒜氨酸酶基因,克隆到pET-28a(+)载体中,构建带有寡聚组氨酸纯化标签的融合蛋白表达质粒。将重组质粒转化入大肠杆菌,经IPTG诱导后的表达产物大部分为包含体,SDS-PAGE电泳和western blotting结果表明目标蛋白的相对分子质量约5.3×104,占菌体总蛋白的45.1%。含6mol/L盐酸胍的溶液,经镍亲和色谱纯化和透析复性,每升摇瓶发酵液可得蛋白143.3mg,得率为13.6%,纯度为97%,蒜氨酸酶的比活力为388u/mg。

柔红霉素产生菌SIPI-1482中dnmV基因功能的阻断及恢复

dnmV基因产物为柔红霉素生物合成途径中TDP-15-脱氧已糖C4酮基还原酶,破坏该基因能阻断柔红糖胺的合成,进而阻断柔红霉素的产生。从天蓝淡红链霉菌(S．coeruleorubidus)SIPI- 1482基因组DNA中经PCR扩增出dnmV及其上游dnmU基因片段,并由此构建了用于阻断dnmV基因的同源重组质粒pYG817,转化SIPI-1482菌株后成功地破坏了dnmV基因,发酵结果显示阻断突变株不再代谢产生柔红霉素,为引入新的基因来改变代谢产物的糖基结构打下了基础。通过导入dnmV基因表达质粒可重建该突变株的生物合成途径,恢复产生柔红霉素,但产量比出发菌株要低。

头孢菌素C酰基转移酶在顶头孢霉中的表达

以假单胞菌的头孢菌素C(CPC)酰基转移酶为基础,根据顶头孢霉密码子偏爱性及RNΑ二级结构预测分析,设计并合成了全长2349bp的CPC酰基转移酶基因ecs,并将其在大肠杆菌中表达。结果证明,表达蛋白能将CPC转化为7-ΑCΑ。将ecs表达质粒转化CPC产生菌顶头孢霉,通过PCR、Southern blotting以及Western blotting等方法验证,表明ecs基因已成功整合到顶头孢霉染色体上并得到表达,重组菌的发酵也显示部分CPC直接转化成了7-ΑCΑ。

天蓝淡红链霉菌SIPI-1482中dnrX基因的敲除及多柔比星产生菌的构建

柔红霉素是合成重要抗肿瘤抗生素多柔比星的前体,由微生物发酵产生。通过PCR从国内柔红霉素生产菌种天蓝淡红链霉菌SIPI-1482基因组DNA中扩增出约1080bp的dnrX部分序列,将PCR扩增片段中985bp的片段亚克隆至大肠埃希菌质粒pYG813构建了同源重组突变质粒pYG963,转化SIPI-1482原生质体并成功地敲除了dnrX基因,得到一株稳定的突变株。该突变株的发酵试验表明dnrX基因所编码的酶的功能已经被有效地阻断,对酸敏感的副产物减少,柔红霉素的产量增加了近3倍,将原野生菌改造成为多柔比星产生菌,发酵效价与原野生菌株柔红霉素的发酵效价相当,为直接发酵法生产多柔比星打下了基础。

受SnpR激活的snpA启动子调控的柔红霉素C-14羟化酶基因的克隆、表达和应用研究

尝试将柔红霉素经微生物转化法合成多柔比星,从Streptomyces sp.C5中通过PCR的方法扩增了含核糖体结合位点、大小为1.3kb的编码C-14柔红霉素羟化酶的doxA基因及受SnpR调控的snpA启动子。最终构建的重组质粒pYG908,能表达一大小为46.6ku的蛋白条带,CO结合差光谱分析表明所表达的酶在450nm有吸收峰。重组质粒转化Streptomyces lividans TK24后,工程菌能转化柔红霉素生成和多柔比星保留时间一样的产物。

柔红霉素C-14羟化酶基因在E.coli中的克隆、融合表达及酶的纯化

doxA基因编码柔红霉素C-14羟化酶(DoxA)。本研究将来自Streptomyces coeruleorubidus SIPI-1482的doxA基因克隆至高效表达载体pET32a中,并在E.coli中表达。经Western blotting实验证明产物融合蛋白表达正确且以包函体形式存在,并初步研究了DoxA的分离纯化方法。