pEGFP-N1-Mxi1-0重组质粒的构建与表达

目的:构建Max作用蛋白1-0(Max interacting protein1-0,Mxi1-0)的真核表达载体,在小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)中表达,以期为深入研究Mxi1-0的作用及机制奠定基础。方法:通过RT-PCR方法从人肿瘤细胞Hep G2中获得Mxi1-0基因的编码片段,连接至增强绿色荧光蛋白真核表达载体(p EGFP-N1)构建成p EGFP-N1-Mxi1-0。经酶切和测序鉴定重组质粒的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光显微镜观察和Western blot方法检测Mxi1-0表达,免疫荧光法检测Mxi1-0在NIH/3T3细胞内的定位情况。结果:经双酶切和核酸序列测序鉴定证实含Mxi1-0的重组真核表达载体p EGFP-Mxi1-0构建成功。重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞后,检测到Mxi1-0的成功表达,并证实Mxi1-0主要定位于NIH/3T3细胞质中。结论:成功构建了真核表达载体p EGFP-N1-Mxi1-0,并检测到Mxi1-0的表达,实验证明Mxi1-0定位于NIH/3T3细胞质中。

过表达Mxi1对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响

目的:构建含有Max结合蛋白1(Mxi1)基因的重组慢病毒载体,并探讨过表达Mxi1基因对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。方法:利用DNA重组技术将Mxi1基因克隆至慢病毒载体,经酶切和测序鉴定后,将重组质粒与慢病毒辅助包装元件质粒共转染293T细胞,获得含Mxi1基因的重组慢病毒。重组慢病毒感染人胃癌SGC-7901细胞,荧光显微镜下观察感染效率,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Mxi1、cyclinB1和caspase-8的基因表达,免疫印迹法(Western blot)检测Mxi1蛋白的表达。CCK-8比色法和流式细胞术分别检测Mxi1基因对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。结果:成功构建含Mxi1基因的慢病毒表达载体,RT-PCR和Western blot检测到Mxi1基因和蛋白的表达。RT-PCR结果显示,过表达Mxi1的SGC-7901细胞与空白对照细胞及过表达空病毒对照细胞相比,细胞内cyclinB1的mRNA表达水平明显降低,而caspase-8的mRNA表达水平显著升高。CCK-8实验和流式细胞术检测结果显示,过表达Mxi1的SGC-7901细胞与空白对照细胞及过表达空病毒对照细胞相比,细胞增殖活性明显降低,细胞凋亡率显著升高。结论:成功构建Mxi1慢病毒载体且有效转染SGC-7901细胞,过表达Mxi1可以抑制胃癌细胞增殖并促进其凋亡。

Galectin-3重组真核表达载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的:构建半乳糖凝集素-3(Gal-3)的真核表达载体,在NIH/3T3细胞中表达,并检测其表达。方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肿瘤细胞克隆Gal-3基因,插入真核表达载体pEGFP-N1中,通过酶切和测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pEGFP-Gal-3瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光和Western blot方法检测Gal-3表达,MTT法检测Gal-3对NIH/3T3细胞增殖的影响。结果 :限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建含Gal-3的重组真核表达载体pEGFP-Gal-3。以重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,检测到Gal-3蛋白表达,并证实Gal-3蛋白促进NIH/3T3细胞增殖。结论:成功构建的pEGFP-Gal-3真核表达载体在小鼠NIH/3T3细胞中成功表达,并促进NIH/3T3细胞增殖。

Max作用蛋白1-0缺失突变体的构建、表达及细胞内定位的研究

目的:构建Max作用蛋白1-0(Max interacting protein1-0,Mxi1-0)缺失突变体的真核表达载体并观察这些突变体在细胞内的定位情况,为研究Mxi1-0细胞内定位与其功能的关系奠定基础。方法:以野生型Mxi1-0真核表达质粒为模板,聚合酶链式反应扩增出5种类型Mxi1-0缺失突变体的基因片段,克隆至增强绿色荧光蛋白真核表达载体,经酶切和测序鉴定后,利用脂质体将重组质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞株(NIH3T3)。Western blot检测融合蛋白的表达,荧光显微镜下观察融合蛋白细胞内定位情况。结果:各种Mxi1-0缺失突变体经测序鉴定正确后,在NIH3T3中得到表达。免疫荧光结果表明,脯氨酸富集结构域(PRD)突变体在细胞质和细胞核中均有分布,与Sin3结合域高度同源结构域(t SID)突变体主要分布于细胞质,在细胞核中有少量分布;PRD-t SID突变体及△PRD突变体分布于细胞质,而△PRD-t SID突变体主要分布于细胞核。结论:成功构建了5种人Mxi1-0缺失突变体的真核表达载体,并初步观察这些突变体在细胞内的定位情况,为探寻Mxi1-0在细胞内定位机制及功能奠定了基础。

Max二聚化蛋白1(Mad1)真核表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的:构建Max二聚化蛋白1(Max dimerization protein 1,Mad1)的真核表达载体,研究Mad1对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法:利用DNA重组技术将Mad1基因克隆至pEGFP-N1载体,构建重组真核表达载体pEGFP-N1-Mad1。经酶切和测序鉴定后,采用脂质体转染技术将重组质粒瞬时转染人胃癌AGS细胞,RT-PCR及Western blot检测Mad1基因和蛋白的表达。荧光显微镜观察Mad1在AGS细胞内的定位情况。CCK-8和Transwell实验研究Mad1对胃癌AGS细胞增殖和迁移能力的影响。结果:成功构建携带Mad1基因的真核表达载体pEGFP-N1-Mad1。将重组质粒瞬时转染AGS细胞后,RT-PCR和Western blot检测到Mad1基因和蛋白的表达。Mad1基因表达产物定位于AGS细胞核中。CCK-8和Transwell实验结果显示,转染Mad1的AGS细胞与转染空载体的AGS细胞及正常AGS细胞相比,细胞增殖活力和迁移能力明显降低。结论:成功构建了真核表达载体p EGFP-N1-Mad1,研究表明Mad1可以抑制胃癌AGS细胞的增殖和迁移。

稳定表达GFP-C-Daam1的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系的建立

目的:构建稳定表达GFP和GFP-C-Daam1的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系,以便进一步研究Daam1对乳腺癌细胞迁移能力的影响。方法:构建表达GFP和GFP-C-Daam1的慢病毒载体,通过慢病毒感染获取稳定表达目的基因的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系。用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞系,Western blot确定重组蛋白表达,并用Boyden chamber小室实验检测细胞运动能力的改变。结果:通过慢病毒感染,建立了稳定表达GFP-C-Daam1的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系,该细胞系具备更强的内在运动能力,表明目的基因的表达产物功能正常。结论:用慢病毒载体可以构建稳定表达GFP-C-Daam1的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系,从而得到研究活化的Daam1的可靠细胞膜型。

ATP缺失对大鼠近端肾小管上皮细胞中肌动蛋白磷酸化水平的影响

目的:研究ATP缺失时大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E)肌动蛋白磷酸化水平的改变。方法:建立细胞的体外ATP缺失模型,用免疫印迹技术检测细胞内骨架组分及胞浆组分中肌动蛋白的分布变化;用二维电泳法分离并比较细胞内磷酸化和非磷酸化的肌动蛋白含量的改变;用免疫共沉淀法及免疫印迹技术检测ATP缺失后细胞内肌动蛋白酪氨酸、苏氨酸及丝氨酸磷酸化水平变化。结果:ATP缺失处理后细胞内F-肌动蛋白含量逐渐增加,G-肌动蛋白含量逐渐减少;ATP缺失细胞内磷酸化肌动蛋白量明显增加,肌动蛋白的磷酸化程度随ATP缺失时间延长而增加;ATP缺失处理后肌动蛋白酪氨酸磷酸化水平逐渐升高,且与ATP缺失程度呈相一致;肌动蛋白苏氨酸磷酸化水平无明显变化。结论:ATP缺失后近端肾小管上皮细胞肌动蛋白出现聚合过程,可能与细胞中肌动蛋白磷酸化酪氨酸水平增加有关。

pEGFP-N1/Arf6-T27N重组真核表达载体的构建及其在人乳腺癌细胞株中的表达

目的:构建含有Arf6-T27N基因的重组真核表达载体,并检测Arf6-T27N蛋白在MDA-MB-231人乳腺癌细胞中的表达情况,以期为深入研究Arf6在乳腺癌细胞迁移中的作用机制奠定基础。方法:从含Arf6-T27N基因的真核表达质粒pXS-Arf6-T27N中扩增出Arf6-T27N基因,插入pEGFP-N1载体中构建成pEGFP-N1/Arf6-T27N,利用脂质体将其转染MDA-MB-231人乳腺癌细胞。用新霉素筛选稳定表达的细胞系,Western blot确定重组蛋白表达,并用Boyden chamber小室实验检测转染Arf6-T27N的MDA-MB-231人乳腺癌细胞迁移能力的改变。结果:限制性内切酶鉴定和核酸定列测定证实成功构建了含Arf6-T27N的重组真核表达载体pEGFP-N1/Arf6-T27N。以重组质粒稳定转染MDA-MB-231人乳腺癌细胞,能检测到Arf6-T27N蛋白的表达,且Arf6-T27N蛋白能明显抑制MDA-MB-231人乳腺癌细胞的迁移。结论:成功构建了重组质粒pEGFP-N1/Arf6-T27N,稳定转染Arf6-T27N的MDA-MB-231人乳腺癌细胞可检测到其蛋白水平的稳定表达,重组质粒介导的Arf6-T27N蛋白能明显抑制MDA-MB-231细胞的迁移。

Max作用蛋白1-0在氧糖剥夺诱导SH-SY5Y细胞凋亡中的作用

目的:探讨Max作用蛋白1-0(max action protein 1-0,Mxi1-0)在氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)诱导SH-SY5Y细胞凋亡中的作用。方法:利用Western blot检测SH-SY5Y细胞在OGD条件下Mxi1-0和线粒体自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、p62、Tom20的表达水平。Mxi1-0 siRNA转染SH-SY5Y细胞,以CCK-8法和Annexin V/PI染色法检测Mxi1-0在OGD诱导细胞凋亡中的作用。结果:OGD条件下,SH-SY5Y细胞中Mxi1-0的表达先上升后下降。OGD处理使线粒体自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达升高,p62和Tom20蛋白表达下降。OGD条件下,Mxi1-0沉默可抑制OGD诱导的线粒体自噬,增强OGD诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。结论:Mxi1-0通过增强线粒体自噬拮抗OGD诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。

稳定表达GFP-V12Rac1的NIH3T3细胞系的建立

目的:构建稳定表达GFP-V12Rac1(组成型活化Rac1的GFP融合蛋白)的NIH3T3细胞系。方法:构建表达GFP-V12Rac1和GFP的质粒和慢病毒载体,通过慢病毒感染和流式分选获取稳定表达目的基因的NIH3T3细胞系。通过铺展实验检测GFP-V12Rac1的功能,通过Boyden chamber迁移实验检测细胞的运动能力。结果:建立了稳定表达GFP-V12Rac1的NIH3T3细胞系及对照细胞系;稳定表达的GFP-V12Rac1可促进NIH3T3细胞的铺展,同时,构建的细胞系具备趋化运动能力。结论:用慢病毒载体可构建稳定表达GFP-V12Rac1的NIH3T3细胞系,外源基因表达产物功能正常且细胞系具备趋化能力。该细胞系可作为研究Rac1活性定位机制的可靠细胞模型。

肺炎支原体23S rRNA基因测序分析的临床应用价值

目的:探讨儿童呼吸道肺炎支原体(MP) 23S rRNA基因测序分析的临床应用价值。方法:收集MP荧光定量PCR≥1×10~4拷贝数的痰或咽拭子样本,行23S rRNA基因V区测序,并按测序结果将患儿分为突变组和未突变组,比较两组患儿的临床资料;将相同样本行体外培养加药敏实验,与测序进行比较。结果:共收集120例样本,98例23S rRNA基因发生2063位点A-> G突变(突变组),22例未检测到突变(未突变组)。两组患儿在性别、年龄、急性期外周血白细胞等一般资料无显著差异,但住院时间、总发热时间、大环内酯类药物治疗后退热时间、咳嗽时间及疗程方面存在统计学差异,且突变组患儿肺外并发症及大叶性肺炎实变率高于未突变组(P <0. 05)。120例样本中48例MP体外培养阳性(阳性率40%),其中20例检出大环内酯类耐药,耐药率为16. 67%,显著低于23S rRNA基因突变率(P <0. 05)。结论:MP 23S rRNA基因突变率较高。突变组临床症状重、疗程长、并发症多,提示基因突变与MP耐药存在相关性。相对于基因测序,体外培养加药敏实验阳性率及耐药率较低。MP 23S rRNA基因测序可作为耐药检测的手段,具有一定的临床价值。