无机离子对磷硫修饰DNA的碘催化断裂反应的显著影响

磷硫修饰DNA(PT-DNA)的断裂反应常被用于检测微生物基因组中PT-DNA的含量,但其检测准确性有待提高。本文研究了Tris-HCl、HEPES、磷酸盐等缓冲溶液和阳离子的种类、浓度对碘断裂PT-DNA的影响,提出了Tris分子参与断裂反应的机制。研究发现,Tris分子能使单链PT-DNA的断裂收率从5%提升至70%以上。对于单链PT-DNA断裂,Na^(+)、Mg^(2+)和Ca^(2+)等阳离子有显著的抑制作用;而双链PT-DNA断裂基本不受上述无机阳离子的影响。当用磷酸钠缓冲溶液代替Tris-HCl时,在低盐条件下PT-DNA只能产生微弱断裂,在高盐条件下双链状态PT-DNA的断裂反而获得了显著的提升;而改用HEPES缓冲液时,无论在高盐还是低盐条件下,PT-DNA的断裂效率都很低。研究结果表明,只有Tris分子结合了PT-DNA氧化后形成的亚磺酸基团才能实现高效断裂,而阳离子可通过调节Tris分子同亚磺酸基团的结合来影响断裂收率。PT-DNA的生物学功能可能是防止弱氧化剂对DNA的破坏(包括断裂或变异),并通过氧化应激启动抗氧化机制。本研究结果还表明,核酸药物在体内可能经氧化途径代谢或脱硫后被核酸酶分解,开发磷硫修饰的核酸类药物时需要考虑这一药物的代谢因素。

重叠延伸PCR生成长重复DNA序列及其在纳米孔测序中的应用

短链DNA的纳米孔测序存在孔道利用率低、数据质量差等问题。因此,亟需建立一种用纳米孔测序技术准确测定短链DNA序列的方法。本研究以1 nmol/L完全互补的序列为引物,以短链DNA为模板,在72℃退火温度下进行PCR,实现了短链DNA的重叠延伸,最终生成长串联重复序列,其产物长度为原始长度的5~20倍。生成的长链DNA可直接测序,仅需对齐单个或少数几个Reads进行简单分析即可获得精确的序列信息。本研究所开发的重叠延伸法将纳米孔One read精确度提高至99.28%,这对提高纳米孔测序的精度具有重要作用。